靳娟娟，姚 玉

(銅川市人民醫(yī)院血液科,陜西 銅川 727100)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)屬于原發(fā)性的惡性漿細(xì)胞腫瘤，是僅次于非霍奇金淋巴瘤的第二大惡性血液系統(tǒng)疾病[1]，起因是B淋巴細(xì)胞在體內(nèi)異常繁殖,克隆漿細(xì)胞產(chǎn)生大量單克隆免疫球蛋白或其片段不斷蓄積，導(dǎo)致機(jī)體多個(gè)臟器發(fā)生損傷[2]，嚴(yán)重危及患者生命安全。最新研究[3-5]表明，該病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，占全身惡性腫瘤發(fā)病率的10%～13%，在美國(guó)全身惡性腫瘤病例中，MM占1.5%，多數(shù)患者生存期少于10年，除此之外，該疾病呈現(xiàn)明顯的年輕化特點(diǎn)。目前MM治療藥物多為糖皮質(zhì)激素，有良好的抗炎及免疫抑制作用，可顯著改善患者預(yù)后、延長(zhǎng)生存期，但長(zhǎng)期使用上述藥物不僅加重患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)而且易產(chǎn)生耐藥性[6-7]，因此探索新的靶點(diǎn)、新機(jī)制成為目前急需解決的問題。MutT同系物1(MutT homolog 1,MTH1)是近年來研究較多的一種焦磷酸酶[8]，存在于脫氧核糖核苷酸三磷酸池中，能糾正活性氧過量引起的氧化損傷，防止細(xì)胞衰老、死亡，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖。大量研究[9-10]表明，MTH1在正常細(xì)胞中是非必需的，但在腫瘤細(xì)胞中是必需的，且在非小細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤疾病組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，因此，近年來MTH1惡性腫瘤的新靶點(diǎn)已成為腫瘤治療的主要研究方向。研究[11]表明MM組織中MTH1高表達(dá)，MTH1會(huì)影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本文主要通過探究MTH1抑制劑對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為進(jìn)一步闡明MTH1抑制劑治療MM的作用機(jī)制提供一定的證據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 試劑：多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266購于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，胎牛血清[125 ml,Absin(上海)生物科技有限公司]，MTH1抑制劑TH588試劑(5 mg,美國(guó)Cheme Gen 生物科技公司)，CD138磁珠購于德國(guó)美天旎Miltenyi生物科技公司，人外周淋巴細(xì)胞分離液(200 ml,P8900,北京索萊寶生物科技有限公司)，Trizol試劑(100 ml，北京百奧萊博科技有限公司)，熒光素酶底物(10 mg/50 mg，美國(guó)Goldbio公司)，上述試劑按照貯存條件進(jìn)行分裝保存。儀器：實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)Q-PCR儀(Quant Studio 5，德國(guó)賽默飛公司)，高速離心機(jī)(TD-5M，山東博科科學(xué)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(Multiskan FC，德國(guó)賽默飛公司)，流式細(xì)胞儀(Cyto Flex，貝克曼庫爾特公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購自德國(guó)賽默飛公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞從液氮罐中取出，置于37 ℃水浴箱中解凍。完全融化后，吸取凍存液于含15%胎牛血清的培養(yǎng)液中，于37 ℃、含氧量95%、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)可開展實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTH1抑制劑TH588對(duì)細(xì)胞增殖的影響：取MM U266細(xì)胞鋪滿整個(gè)48孔培養(yǎng)板(5×103個(gè)/孔)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔100 μl培養(yǎng)液。按照0.0、1.5、3.0、6.0、9.0 μmol/L的TH588的濃度梯度，將所有培養(yǎng)板分成五組，每組3板，置于37 ℃、含氧量95%、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，分別于0、48、72 h后每孔避光加入10 μl的熒光素底物，采用Multiskan FC酶標(biāo)儀測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)每孔懸液的熒光強(qiáng)度。同時(shí)，另取MM U266細(xì)胞轉(zhuǎn)染于24孔培養(yǎng)板上，加入上述濃度梯度的MTH1抑制劑TH588，于0、48、72 h后，用Trizol試劑提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，Q-PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)MTH1表達(dá)水平的變化情況。

1.2.3 MTH1抑制劑TH588對(duì)細(xì)胞凋亡的影響：取1.2.1中多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞轉(zhuǎn)染于24孔培養(yǎng)板上，加入上述濃度梯度的MTH1抑制劑TH588，于72 h后收集細(xì)胞，采用Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白(Annexin V)合并碘化丙啶(PI)染色法共同捕獲凋亡細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，當(dāng)對(duì)該方法呈雙陰性結(jié)果時(shí)，說明該細(xì)胞為活細(xì)胞，未發(fā)生凋亡。

2 結(jié) 果

2.1 MTH1抑制劑TH588對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266增殖的影響 見表1、2。通過提取RNA進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)每孔懸液的熒光強(qiáng)度及不同濃度抑制劑作用下MTH1表達(dá)水平的變化情況，結(jié)果表明，同一濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，不同濃度下隨TH588濃度的升高，熒光強(qiáng)度有所降低，且均顯著低于0.0 μmol/L濃度組(均P<0.05)；MTH1的表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)也表現(xiàn)出明顯升高趨勢(shì)，同一時(shí)間點(diǎn)經(jīng)TH588處理組表達(dá)顯著低于0.0 μmol/L濃度組，隨著TH588的濃度升高，MTH1表達(dá)水平呈明顯降低趨勢(shì)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 不同濃度TH588作用于U266細(xì)胞熒光強(qiáng)度比較

2.2 MTH1抑制劑TH588對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266凋亡的影響 見表3。采用Annexin V/PI雙染色法測(cè)定TH588對(duì)MM U266細(xì)胞凋亡特性的影響，結(jié)果表明，隨TH588濃度的升高，Annexin V/PI染色雙陰性細(xì)胞的比例顯著降低，且濃度越高，降低越明顯，與0.0 μmol/L組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 不同濃度TH588作用于U266細(xì)胞后MTH1的表達(dá)量

表3 不同濃度TH588對(duì)U266細(xì)胞凋亡的影響(%)

3 討 論

MM是一種漿細(xì)胞惡性增生血液系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)為貧血、急慢性腎衰竭、凝血功能障礙、高鈣血癥、溶骨性骨質(zhì)破壞等癥狀[11-12]，嚴(yán)重危及患者生命安全。糖皮質(zhì)激素是目前報(bào)道最多的治療MM的藥物，通過刺激骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗炎及免疫抑制作用[13-14]，與蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑等靶向藥物共同作用，改善患者生存質(zhì)量，但該治療方法存在耐藥性缺陷，因此探索新的靶點(diǎn)、新機(jī)制是目前臨床治療MM的主要研究方向[15]。MTH1是焦磷酸酶NUDIX家族一員，能減少活性氧過量對(duì)鳥嘌呤造成的氧化損傷，即水解8-氧代-dGTP成單磷酸形式，阻止細(xì)胞氧化衰老，是肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤的新靶點(diǎn)[16]。因此，本文主要探索MTH1及其抑制劑TH588對(duì)MM細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為開發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供證據(jù)支持。

Satomi等[17]報(bào)道顯示，MTH1作為腫瘤細(xì)胞常見靶點(diǎn)，在多種癌癥疾病組織中呈現(xiàn)高表達(dá)的特點(diǎn)，進(jìn)一步說明MTH1表達(dá)水平與MM具有明顯的相關(guān)性，也驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)選取MTH1抑制劑TH588對(duì)細(xì)胞生物特性有一定的合理性。

通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度探究TH588對(duì)細(xì)胞生物特性的影響，本實(shí)驗(yàn)將不同濃度TH588直接作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MM U266細(xì)胞，熒光測(cè)定結(jié)果顯示，TH588濃度越高熒光強(qiáng)度越低，表明TH588能夠明顯的抑制U266細(xì)胞增殖。Petrocchi等[18]研究發(fā)現(xiàn)TH588抑制肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖可能與抑制細(xì)胞有絲分裂G2期DNA的復(fù)制、細(xì)胞分裂期以及酶與紡錘絲蛋白質(zhì)的合成有關(guān)。研究[7]發(fā)現(xiàn)MTH1自身不是正常細(xì)胞必需的蛋白，能防止細(xì)胞進(jìn)入正常的氧化衰老、凋亡過程，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，而TH588能明顯抑制U266細(xì)胞中MTH1的表達(dá)，對(duì)臨床開發(fā)新靶點(diǎn)的蛋白酶抑制劑治療MM有一定的指導(dǎo)意義。

最后Annexin V/PI雙染色凋亡實(shí)驗(yàn)表明，TH588濃度越高，雙陰性細(xì)胞比例越低，說明該細(xì)胞膜未破損，染色劑未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，且該U266細(xì)胞為活細(xì)胞，其比例越低表明TH588濃度越高，對(duì)U266細(xì)胞的破壞率越高，從而促使腫瘤細(xì)胞凋亡最終達(dá)到治療疾病的目的；吳曉波等[19]、Stewart等[20]通過探究TH588對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞生物特性的影響也發(fā)現(xiàn)該抑制劑能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖。雖然目前對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用尚不清楚，但作為U266細(xì)胞新靶點(diǎn)的抑制劑，TH588具有一定的臨床開發(fā)價(jià)值。

綜上所述，MTH1抑制劑TH588表現(xiàn)出顯著的抑制U266細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用，且有明顯的量效關(guān)系，此為臨床開發(fā)治療MM的新靶點(diǎn)藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。