孫 育，劉朝陽，劉英潔

(西北婦女兒童醫(yī)院，陜西 西安 710061)

卵巢癌發(fā)病率僅次于子宮體癌和子宮頸癌，是女性生殖器官最難治療的惡性腫瘤之一[1]，嚴重影響廣大患者的生活質(zhì)量和壽命。卵巢上皮癌是最常見的卵巢惡性腫瘤，其病死率在各類婦科腫瘤中排首位，對女性生命造成嚴重威脅[2-3]。由于直到癌癥廣泛擴散臨床上才可能觀察到癥狀，因此在該疾病的早期階段診斷僅僅占所有患者的四分之一。目前，手術(shù)與細胞毒性化學(xué)療法相結(jié)合可在超過一半以上的患者中產(chǎn)生良好的臨床反應(yīng)[2]。紫杉醇和鉑類是該聯(lián)合治療方案中使用的兩種藥物。但大多數(shù)患者接受紫杉醇和鉑類聯(lián)合治療后，最終仍會復(fù)發(fā)[4]。腫瘤常見的治療方法如手術(shù)切除、藥物治療和放射治療等均不能起到理想的治療效果[5]，基于此，尋求簡便易行且安全有效的治療方法極為重要。文獻[6]報道，中藥單體比如龍葵堿等具有抑制腫瘤細胞體外增殖的作用。另據(jù)文獻[7]報道從中藥黃連、黃柏中提取的小檗堿具有降血脂、抗癌、抗氧化等作用。最新研究[8]表明，小檗堿可以通過抑制血管生成進而促進癌細胞凋亡，但其對人卵巢癌上皮細胞體外增殖以及β-catenin信號通路的影響尚不清楚。本研究旨在探討小檗堿對人卵巢癌上皮細胞增殖的影響及其機制，藉此為防治卵巢癌尋找新的藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HO-8910細胞株(人卵巢癌上皮細胞)購自廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司。小檗堿購于成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%，小檗堿溶于DMSO。DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)、青霉素/鏈霉素雙抗(美國Gibco 公司)，CCK8試劑購于美國Apexbio公司，細胞周期檢測試劑盒(中國碧云天生物公司)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天生物公司)，細胞周期試劑盒試劑盒購于美國BD公司，Cyclin D1、 p21、β-catenin 和GAPDH 抗體均購于中國博士德生物公司，免疫組化試劑盒購于美國Cell Signal Technology有限公司。流式細胞儀購于美國BD Pharmingen 公司，轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad 公司)，全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo 公司)，倒置顯微鏡(德國奧林巴斯公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：HO-8910細胞株由DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，DMEM 完全培養(yǎng)基包含1% 雙抗，10%胎牛血清，培養(yǎng)基3 d更換1次，細胞長勢達到70%～80% 時，對細胞進行消化、傳代和接種。

1.2.2 CCK8法檢測小檗堿對HO-8910細胞株活力的影響：將HO-8910細胞培養(yǎng)到對數(shù)期，消化并計數(shù)，按照3×103個/孔接種于96孔板中，向?qū)?yīng)試驗孔中分別加入含有不同濃度的小檗堿(0、12.5、25、50、100 μmol/L)DMEM完全培養(yǎng)基,每個濃度組設(shè)3 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，將10 μl CCK-8染液加入到100 μl細胞培養(yǎng)液中，37 ℃條件下繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀在490 nm測量吸光度。

1.2.3 流式細胞法檢測小檗堿對HO-8910細胞周期分布的影響：將HO-8910細胞株以每孔3×105個/ml的密度接種至6 孔培養(yǎng)板，次日，加入不含小檗堿或含有50 μmol/L 小檗堿的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，消化轉(zhuǎn)移至離心管中，1000 r/min 離心5min。收集細胞，用預(yù)冷PBS在4 ℃冰箱固定4 h，參照試劑盒說明書的步驟檢測細胞周期。

1.2.4 Western blot 檢測小檗堿對HO-8910細胞增殖相關(guān)蛋白表達的影響：將HO-8910細胞株消化傳代，并以每孔3×105個/ml的密度接種至6 孔培養(yǎng)板，次日，加入不含小檗堿或含有50 μmol/L 小檗堿的DMEM完全培養(yǎng)基處理24 h，倒掉培養(yǎng)基，參考BCA試劑盒進行蛋白質(zhì)提取和蛋白濃度測定。每孔上樣30 μg，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，之后用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，分別加入一抗β-catenin(1∶1000)、Cyclin D1(1∶1000)、p21(1∶1 000)和GAPDH(1∶1000)稀釋液，將膜放入4 ℃冰箱搖床上，孵育過夜，次日加入TBST洗3 次，分別加入二抗(1∶3000)稀釋液，用ECL 發(fā)光液浸膜 5 min，用凝膠成像儀進行顯色反應(yīng)并拍照記錄，用GAPDH作為內(nèi)參，用Image Lab 3.0軟件進行條帶定量分析。

1.2.5 RT-PCR法：將HO-8910細胞株消化傳代，并以每孔3×105個/ml的密度接種至6 孔培養(yǎng)板，次日，加入不含小檗堿或含有50 μmol/L 小檗堿的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)24 h后的各組細胞，棄去培養(yǎng)基，采用Trizol法提取RNA。以cDNA為模板進行RT-PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA 的相對表達量，GAPDH作為內(nèi)參，各引物序列見表1。

2 結(jié) 果

2.1 小檗堿對HO-8910細胞活力的影響 見圖1。當(dāng)小檗堿濃度為12.5、25 μmol/L 時，小檗堿對HO-8910細胞株活性沒有顯著作用，當(dāng)小檗堿濃度為50、100 μmol/L 時，小檗堿顯著抑制HO-8910細胞株活性，與對照組(0 μmol/L小檗堿組)相比，其組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，本研究在后續(xù)實驗中選用50 μmol/L小檗堿為小檗堿組。

注：與0 μmol/L小檗堿組比較，**P<0.01

2.2 小檗堿對HO-8910細胞株細胞周期的影響 見表2。小檗堿組G0/G1期細胞百分比與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，小檗堿組中S期細胞百分比與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 兩組細胞周期分布比較(%)

2.3 小檗堿對HO-8910細胞株增殖相關(guān)蛋白 mRNA表達水平的影響 見圖2 。與對照組相比，小檗堿組中，β-catenin和Cyclin D1 mRNA表達量顯著減少(P<0.05、P<0.01)，p21 mRNA表達量顯著增加(P<0.01)。

2.4 小檗堿對HO-8910細胞株增殖相關(guān)蛋白表達水平的影響 見圖3。與對照組相比，小檗堿組中，β-catenin和Cyclin D1蛋白表達量顯著減少(P<005、P<0.01)，p21蛋白表達量顯著增加(P<0.01)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

卵巢癌是臨床婦科最常見和最棘手的惡性腫瘤之一，其難于早期發(fā)現(xiàn)且發(fā)病機制尚未完全清楚，因此，多年來卵巢癌病死率穩(wěn)居婦科第一[9]。目前，手術(shù)、化療以及放療仍是臨床上主要的診治方法，但對患者具有較大的創(chuàng)傷和不良反應(yīng)[10]，而中藥活性單體具有來源廣泛、廉價，治療安全有效的特點，未來中藥活性單體具有廣闊的應(yīng)用前景。

小檗堿是一種生物堿，研究[11-12]發(fā)現(xiàn)小檗堿促進癌細胞凋亡是通過抑制巨噬細胞的形成介導(dǎo)的。本研究通過CCK8實驗和細胞周期實驗發(fā)現(xiàn)小檗堿可顯著抑制HO-8910細胞增殖，并抑制細胞從G0/G1期向S 及G2期細胞轉(zhuǎn)變。RT-PCR和Western blot探明了小檗堿可顯著抑制HO-8910細胞增殖的作用機制，即小檗堿抑制了HO-8910細胞株β-catenin、Cyclin D1和p21蛋白和mRNA的表達。文獻[13]報道，小檗堿通過降低Bcl-2、MMP-9、NF-κB p65表達及提高Bax表達，有效抑制宮頸癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，小檗堿通過將細胞阻滯于G0/G1期，并能夠阻斷NF-κB信號通路，從而抑制子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移[14]。本研究中，小檗堿通過抑制細胞從G0/G1期向S 及G2期細胞轉(zhuǎn)變進而抑制HO-8910細胞增殖這一結(jié)果與已報道的小檗堿可抑制卵巢癌細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡相符[15]。

Wnt/β-catenin一般通路較多參與腫瘤的形成和發(fā)展，決定著腫瘤細胞增殖和凋亡的去向[9]。β-catenin是Wnt/β-catenin 信號通路的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，在腫瘤中表達上調(diào)[16]，在各類細胞中起著粘連并傳遞信號的作用[17]，β-catenin與人類癌癥中的致癌活性有關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，β-catenin參與了卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[18-19]。Cyclin D1在調(diào)節(jié)細胞周期進程中起著至關(guān)重要的作用。Lin等[20]發(fā)現(xiàn)了一個完美的T細胞因子4(Tcf4)結(jié)合位點(CTTGATC)，位于Cyclin D1啟動子區(qū)域中的核苷酸-80和-73之間，提示β-連環(huán)蛋白/Tcf4途徑可能參與了對T細胞因子4的調(diào)控下Cyclin D1表達。文獻[21]報道在乳腺癌細胞系中，β-catenin/Tcf4途徑參與細胞 Cyclin D1啟動子的激活。Cyclin D1和p21是細胞周期調(diào)控極為重要的調(diào)節(jié)因子，Cyclin D1主要參與細胞周期的基因突變和隨后細胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)變[22]。p21 作為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CKIs)家族成員之一，可通過與Cyclin/CDK 蛋白激酶復(fù)合體相結(jié)合而抑制酶的活性，p21對CDK的抑制會在細胞周期的G1和G2階段觸發(fā)細胞周期停滯[23]，p21基因既與腫瘤抑制作用密切相關(guān)，又能通過抑制周期素依賴激酶復(fù)合物活性，協(xié)調(diào)細胞周期、DNA復(fù)制與修復(fù)之間的關(guān)系，從而將腫瘤抑制作用與細胞周期控制過程緊密相連[24]。本研究中，小檗堿抑制了HO-8910細胞株Cyclin D1并促進p21的表達，導(dǎo)致細胞周期停滯在G1期，進而抑制了HO-8910細胞進一步增殖。此外，本研究的不足之處在于沒有檢測小檗堿對HO-8910細胞凋亡蛋白指標(biāo)的影響，尚需進一步研究。

綜上所述，小檗堿可通過抑制細胞內(nèi)周期蛋白表達抑制HO-8910細胞增殖。該結(jié)果為小檗堿的抗癌作用提供了堅實的實驗依據(jù)。