來 靜，李 娜，李 超

(1.安康市中心醫(yī)院,陜西 安康 725000;2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院,陜西 西安 710061)

急性肺損傷是一種以通透性肺水腫為典型臨床特征的綜合性疾病，是指因各種直接或間接致傷原因導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞的損傷,患者常出現(xiàn)彌漫性肺間質及肺泡水腫，發(fā)生急性低氧性呼吸功能不全[1-3]。其典型病理生理特征包括肺容積減少、肺順應性降低、通氣/血流比例失調(diào)等，臨床表現(xiàn)包括進行性低氧血癥、呼吸窘迫等，影像學檢查可顯示為非均一性的滲出性病變，發(fā)展至嚴重階段可成為急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratry distress syndrome，ARDS)[4-6]。急性肺損傷的病因較為復雜，流行病學調(diào)查顯示，2005年美國急性肺損傷的發(fā)病率達到了79/10萬，嚴重感染患者急性肺損傷發(fā)生率約為25%～50%，多發(fā)性創(chuàng)傷發(fā)生率約為11%～25%，總體數(shù)據(jù)調(diào)研顯示急性肺損傷的病死率在15%～72%之間[7-8]。已有的研究[9-11]顯示，高糖狀態(tài)是急性肺損傷的獨立危險因素，高血糖不僅會導致血管內(nèi)皮功能紊亂，同時還會誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡，而通過改善血管內(nèi)皮細胞功能，對改善因急性肺損傷引起的微血管內(nèi)皮細胞損傷具有積極意義。利拉魯肽是胰高血糖素樣肽1(GLP-1)類似物[12]，已有的研究[13]指出，利拉魯肽能夠通過作用于PI3K信號通路來改善缺氧乳鼠心肌細胞凋亡進程，從而發(fā)揮一定的心肌保護作用。近些年還有學者發(fā)現(xiàn)GLP-1受體在肺微血管等組織中也有表達[14-15]，這為急性肺損傷的治療提供了理論基礎。本研究通過設置細胞對照實驗的方式，探究利拉魯肽對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞生物進程的影響,以期為急性肺損傷的治療提供新方向。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 選擇出生5～6 d的體重在10～15 g的SD大鼠(購于北京清析技術研究院)，高糖DMEM(Thermo Fisher Scientific)，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)(美國Sigma公司)，胎牛血清(Ausbian)，利拉魯肽(諾和諾德公司)，PISK/Akt阻斷劑LY294002(東蒼生物)，酶標儀(Biotek)。

1.2 實驗方法

1.2.1 微血管內(nèi)皮細胞分離與培養(yǎng)：取大鼠左肺75%乙醇浸泡15 s，清洗后剪碎，Ⅰ型膠原酶和胰蛋白酶于37 ℃條件下各消化10 min，離心后重懸于培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除懸浮未貼壁細胞后繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞80%融合生長后使用胰蛋白酶消化傳代，而后使用LPS 50 ng/ml刺激細胞生長6 h。

1.2.2 實驗分組：在觀察最適合細胞生長濃度時，分別設置0、1、10 、100 、1000 nmol/L五個濃度梯度的利拉魯肽干預組；在觀察利拉魯肽通過作用PI3K/Akt信號通路對細胞蛋白表達、增殖遷移能力影響時區(qū)分為正常細胞組(0 nmol/L)、利拉魯肽組(100 nmol/L)和100 nmol/L利拉魯肽+10 μmol/L LY294002組。上述分組下藥物作用時間均為24 h。

1.2.3 MTT法繪制細胞生長曲線：將細胞區(qū)分為五組后進行正常培養(yǎng)，細胞貼壁后按照分組予以各組不同濃度利拉魯肽干預，每組細胞均接受藥物干預24 h，而后加入MTT溶液，酶標儀570 nm下檢測光吸收值，計算每組吸光度平均值并繪制細胞生長曲線。

1.2.4 Western blot檢測Akt表達：三組細胞按照分組使用藥物干預結束后，提取總蛋白，選擇10%的SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳進行分離，分別使用PVDF洗膜、TBST洗膜后以β-actin作為內(nèi)參，使用Quantity One軟件采集信號后計算蛋白表達情況。

1.2.5 Brdu檢測細胞增殖情況：三組細胞使用藥物處理完畢后，加入含有Brdu的培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h，固定液固定20 min后封阻液封閉30 min，加入抗體液并培養(yǎng)30 min后加入熒光液，避光培養(yǎng)30 min，最后加入復染液，于熒光顯微鏡下計算各組的紅色熒光細胞所占的百分數(shù)。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移情況：將1代細胞置于培養(yǎng)皿上，分別使用利拉魯肽和LY294002進行處理后，待細胞生長至80%～90%開始實驗，劃痕結束后細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最后顯微鏡下觀察各組細胞向劃痕其余區(qū)域遷移的距離(cm)。

2 結 果

2.1 不同濃度利拉魯肽對細胞增殖能力影響 待細胞貼壁生長24 h后，將細胞進行分組后分別使用0、1、10 、100、1000 nmol/L五個濃度梯度的利拉魯肽進行干預，每24 h檢測一次A570值，MTT繪制細胞生長曲線并開展組間差異性比較，結果顯示，在同一時間點上，A值會隨著利拉魯肽濃度的升高而顯著升高，在100 nmol/L時細胞達到最高促生長濃度，優(yōu)于其他組別(均P<0.05)，繼續(xù)增加利拉魯肽濃度至1000 nmol/L并沒有增加細胞增殖能力，見圖1。

圖1 不同濃度利拉魯肽對細胞增殖能力影響

2.2 利拉魯肽對肺微血管內(nèi)皮細胞PI3K/Akt信號通路蛋白影響 將細胞區(qū)分為正常細胞組(0 nmol/L)、利拉魯肽組(100 nmol/L)和利拉魯肽+LY294002組(100 nmol/L利拉魯肽+10 μmol/L LY294002),正常干預后使用Western blot法檢測p-Akt、Akt的表達情況，結果顯示同正常細胞組相比，利拉魯肽組細胞內(nèi)的Akt、p-Akt表達水平顯著升高(均P<0.05)，為進一步驗證PI3K/Akt信號通路在蛋白表達中的意義，使用通路阻斷劑LY294002進行干預后發(fā)現(xiàn)，細胞中Akt、p-Akt表達水平顯著降低(均P<0.05)，見表1。

表1 利拉魯肽對肺微血管內(nèi)皮細胞PI3K/Akt信號通路蛋白影響

2.3 利拉魯肽對細胞增殖能力影響 Brdu結果顯示，相比于正常細胞組，利拉魯肽組細胞出現(xiàn)明顯的增殖現(xiàn)象(P<0.05)，而應用通路阻斷劑處理后，利拉魯肽+LY294002組細胞的增殖情況明顯較利拉魯肽組細胞出現(xiàn)降低(P<0.05)，見表2。

表2 利拉魯肽對細胞增殖能力影響(%)

2.4 利拉魯肽對細胞遷移能力影響 通過劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，相比于正常細胞組，利拉魯肽的加入可以顯著促進肺微血管內(nèi)皮細胞向劃痕空白區(qū)域的遷移生長(P<0.05)，而加入通路阻斷劑進行處理后，再次比較顯示利拉魯肽+LY294002組細胞相較利拉魯肽組細胞遷移能力顯著下降(P<0.05)，見表3。

表3 利拉魯肽對細胞遷移能力影響(cm)

3 討 論

微血管是指直徑在200 μm以下的血管，微血管內(nèi)皮細胞是血液和周圍組織之間開展物質交換的主要屏障，同時微血管能夠合成和分泌多種生物活性物質，從而發(fā)揮抗炎、再生血管等重要功能，因而微血管的血液灌注對于組織正常功能的發(fā)揮起到重要作用[16-17]。肺微血管內(nèi)皮細胞是氣血屏障的重要組成部分，已有的研究[18-19]指出在多種肺相關炎癥、損傷等引起的病理進程如急性肺損傷、ARDS中微血管內(nèi)皮細胞通透性增加是上述病理改變的中心環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的研究認為急性肺損傷是由肺微血管內(nèi)皮細胞受損所致，但對于肺微血管內(nèi)皮細胞損傷機制等認識不足，對其病理生理進程尚不清楚[20]。近些年隨著分子生物學的不斷進步，關于急性肺損傷相關信號通路的研究不斷深入，多種信號通路在上述病理進程中發(fā)揮的作用被逐漸揭示。

本研究通過開展體外細胞實驗的方式，詳細論證了利拉魯肽對LPS誘導大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞生物進程的影響，并初步探究了PI3K/Akt信號通路在影響肺微血管內(nèi)皮細胞生物進程中所發(fā)揮的作用。研究結果顯示，利拉魯肽可以通過作用于PI3K/Akt信號通路進而促進肺微血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移進程，該結論通過應用PI3K/Akt信號通路阻斷劑LY294002得到了進一步的印證，說明了利拉魯肽對于肺微血管內(nèi)皮細胞具有較明顯的干預效果。已有的研究[21]指出，細胞的遷移和增殖都會對血管再生和修復進程產(chǎn)生明顯影響，通過促進細胞遷移和增殖能夠縮短血管再生進程，加快受損血管的修復。GLP-1最早在糖尿病中發(fā)現(xiàn)可以促進β細胞和胰腺小島內(nèi)皮細胞的增殖，近些年GLP-1在心血管相關疾病的防治中發(fā)揮了重要作用，研究[22-23]證實GLP-1類似物諸如Exendin-4能夠通過激化PKA-PI3K/Akt-eNOS信號通路來促進細胞DNA的合成，這種促增值作用也呈現(xiàn)明顯的濃度和時間依賴性，在10 nmol/L濃度下作用24～48 h時增值作用最為明顯，這與文中100 nmol/L利拉魯肽干預下肺微血管內(nèi)皮細胞增殖最為明顯類似。

還有學者認為在創(chuàng)傷性血管疾病修復進程中，內(nèi)皮增殖、遷移是促進再血管化的關鍵指標，該學者通過體內(nèi)和體外實驗研究證實GLP-1可以通過受體依賴途徑促進HUVECs細胞在劃痕實驗中的遷移，但該學者未對其分子機制開展進一步的論證研究[24]。本研究則通過設立不同組別的方式研究發(fā)現(xiàn)，同正常細胞組相比，利拉魯肽的加入明顯加快了肺微血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖進程，為驗證該機制與PI3K/Akt信號通路的關系，文中設立了利拉魯肽+PI3K/Akt信號通路阻斷劑LY294002組，結果顯示加入信號通路阻斷劑后，實驗細胞的遷移和增殖能力都出現(xiàn)了顯著的下降，這說明了PI3K/Akt信號通路是影響實驗細胞增殖遷移的關鍵信號通路之一。吳振華等[25]通過設立心肌微血管內(nèi)皮細胞體外實驗的方式，驗證了利拉魯肽是通過激活細胞內(nèi)PI3K/Akt和MAPK/EPK信號通路，從而促進原代大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移進程，這印證了本研究結果的真實性。

綜上所述，利拉魯肽對LPS誘導大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的生物進程會產(chǎn)生顯著影響，分析其原因可能與利拉魯肽能夠作用于PI3K/Akt信號通路有關。