劉 近，任雪建，楊 轉(zhuǎn)，姬杰菲

(禾旭(鄭州)生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450000)

0 引言

牛傳染性鼻氣管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起的一種牛的傳染病，表現(xiàn)為上呼吸道感染及氣管黏膜炎癥，呼吸困難，一般伴隨著發(fā)熱、沉郁、食欲不振、流產(chǎn)和產(chǎn)奶量下降等癥狀[1]。牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)所有蛋白中g(shù)B、gC、gD和gE 4個(gè)糖蛋白是IBRV的主要抗原，而gD蛋白被認(rèn)為是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要糖蛋白，它不但能誘導(dǎo)體液免疫，還可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫[2]，是目前IBRV特異性診斷的主要抗原。

該病呈世界性流行，我國部分地區(qū)也多有發(fā)生。IBR被國際獸疫局(OIE)列為B類疾病，在我國《中華人民共和國進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病名錄》中也被列為二類傳染病[3]。牛傳染性鼻氣管炎病毒危害巨大，加強(qiáng)牛傳染性鼻氣管炎病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)有助于疾病的早期診斷和防治[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1)試劑與樣品。牛傳染性鼻氣管炎gD重組蛋白(公司實(shí)驗(yàn)室保存)、IBRV單克隆抗體(公司實(shí)驗(yàn)室保存)、牛血清樣本(公司采集的臨床樣本)、比對(duì)試劑盒(購自IDEXX公司)。

2)主要儀器設(shè)備:酶標(biāo)儀(購自Thermo)、恒溫培養(yǎng)箱(購自林茂科技(北京)有限公司)、冰箱(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)、離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)、移液槍(賽默飛)。

1.2 結(jié)果判定

當(dāng)S/N≥0.5時(shí)，判定為陰性；當(dāng)S/P<0.5時(shí)，判定為陽性。

1.3 試驗(yàn)條件的確定

1)對(duì)包被液的初步篩選。按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)，封閉液用1.5%Casein、包被抗原用牛傳染性鼻氣管炎病毒gD重組蛋白、酶標(biāo)標(biāo)記牛傳染性鼻氣管炎病毒的單克隆抗體，在以上條件的工作濃度均為為1/1 000的情況下，分別選用CB、1/10CB、0.2M PB、0.02M PB、0.01M TB為包被液進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 gD重組蛋白包被液篩選

通過試驗(yàn)對(duì)5種包被液進(jìn)行比較，初步確定包被液為0.02M PB、封閉液為1.5% Casein酪蛋白、gD重組蛋白包被濃度1/1 000、酶標(biāo)單抗?jié)舛葹?/1 000。

2)對(duì)封閉液，gD重組蛋白包被濃度及酶標(biāo)單抗工作濃度進(jìn)行初步篩選。結(jié)果顯示，當(dāng)封閉液選用1.5% Casein，gD重組蛋白包被濃度為1/1 000，酶標(biāo)單抗工作濃度為1/1 000時(shí)，抗原抗體使用效價(jià)最高且陰陽區(qū)分明顯。

3)對(duì)酶結(jié)合物稀釋液篩選。在初步確定包被液為0.02M PB、封閉液為1.5% Casein酪蛋白、gD重組蛋白包被濃度為1/1 000、酶標(biāo)單抗?jié)舛葹?/1 000的基礎(chǔ)上，分別以gB酶稀、鴨疫酶稀、豬瘟酶稀、豬瘟酶稀、小反芻酶稀和PBST作為酶結(jié)合物稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果小反芻酶稀陰陽區(qū)分最明顯，因此本試驗(yàn)選用小反芻酶稀作為酶結(jié)合物稀釋液。

4)陰陽判定條件的確定。用ROC曲線來確定臨界值，敏感性代表陽性檢出率，特異性代表因陰性檢出率；用競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)樣本178份，由ROC曲線可得，當(dāng)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)>0.516時(shí)，Youden指數(shù)最大，所以確定S/P=0.5為臨界值；即當(dāng)S/N≥0.5時(shí)，判定為陰性；S/P<0.5時(shí)，判定為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密性

2.1.1 板內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)

在同一板內(nèi)用同一牛血清進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)，計(jì)算變異系數(shù)，計(jì)算可得，板內(nèi)OD值的平均值為1.083，標(biāo)準(zhǔn)差為0.083，變異系數(shù)為7.7%，低于10%，符合板內(nèi)精密度要求。

2.1.2 板間精密度實(shí)驗(yàn)

從12塊不同包被板上分別各取一列組成新板，然后用同一牛血清在相同條件下進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)，計(jì)算變異系數(shù)，計(jì)算可得，板內(nèi)OD值的平均值為0.933，標(biāo)準(zhǔn)差為0.088，變異系數(shù)為9.41%，低于15%，符合板間精密度要求。

2.2 熱穩(wěn)定性

2.2.1 包被板熱穩(wěn)定性考察

選取8個(gè)樣本，在4℃、37℃下分別放置7 d、11 d測(cè)包被板的OD值考察熱穩(wěn)定性，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果包被板37℃放置7 d，11 d包被板的OD值沒有明顯降幅，熱穩(wěn)定性良好。

2.2.2 酶結(jié)合物熱穩(wěn)定性考察

將4組酶結(jié)合物在4℃和37℃條件下分別放置7 d、11 d，測(cè)其OD值評(píng)價(jià)熱穩(wěn)定性，數(shù)據(jù)可得，酶37℃放置7 d降幅20%左右，11 d降幅22%左右，酶結(jié)合物熱穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

1)本試驗(yàn)以gD蛋白重組蛋白為包被抗原建立了牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件是封閉液用1.5%Casein酪蛋白、包被液用0.02M的PB溶液、包被濃度為1/1 000，酶標(biāo)單抗?jié)舛葹?/1 000，酶稀釋液為小反芻酶稀時(shí)，該競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的靈敏度和穩(wěn)定性最佳。

2)在IBRV的主要蛋白中g(shù)D基因編碼的糖蛋白免疫原性良好，能夠誘導(dǎo)最好水平的免疫應(yīng)答抗體[5]。除此之外，它能夠同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，因此也可以對(duì)IBRV疫苗免疫牛的免疫情況進(jìn)行評(píng)價(jià)[6]。Hutchings[7]等分別用gB、gC和gD免疫鼠和牛，結(jié)果顯示gD糖蛋白引起的細(xì)胞免疫效果更高而持久。祖立闖[8]等以截短表達(dá)的gD蛋白作為抗原建立IBRV間接ELISA檢測(cè)方法，與全病毒ELISA相比較具有較高的敏感性和特異性。因此，在IBRV的所有蛋白中g(shù)D 蛋白被作為IBRV特異性抗原研究的首選。

3)本研究建立的gD-競(jìng)爭(zhēng)ELISA診斷方法，除了能夠?qū)Ω腥九＿M(jìn)行診斷，還能用于IBRV疫苗免疫的免疫情況評(píng)價(jià)，為我國IBR的診斷、疫苗免疫水平監(jiān)測(cè)進(jìn)出口檢疫等提供了一種簡(jiǎn)單的、快速的、價(jià)格低廉的血清學(xué)診斷方法，一定程度上促進(jìn)了養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。