唐 莉，唐國(guó)英

（重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院，重慶 405400）

肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性肺炎最常見的病原體。肺上皮細(xì)胞排列在呼吸道上，構(gòu)成了對(duì)抗呼吸道病原體的天然防線，感染后，肺部會(huì)出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，肺泡上皮細(xì)胞的凋亡是細(xì)菌性肺部感染的主要病理特征[1]。miRNA作為細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)控分子，在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。戢慧等[3]采用基因芯片技術(shù)篩選和RT-PCR驗(yàn)證Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（AECⅡ）凋亡相關(guān)miRNA 時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-449a-5p在模型中表達(dá)下調(diào)，miR-449a-5p可能在AECII 凋亡調(diào)控中起關(guān)鍵作用。但miR-449a-5p 對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制目前還不清楚。本研究以AECⅡ細(xì)胞為研究對(duì)象，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染和肺炎鏈球菌干預(yù)后，探討miR-449a-5p在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用，以期為肺炎的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 DMEM/F12 培養(yǎng)基、Annexin VFITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Western blot 相關(guān)試劑購(gòu)于北京索萊寶公司；胎牛血清購(gòu)于Hyclone 公司；LipofectamineTM 2000 相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Invitrogen 公司；白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海紀(jì)寧公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海碧云公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega 公 司；miR-NC、miR-449a-5p mimics、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Bax、WT-Bax和MUT-Bax的構(gòu)建和測(cè)序由上海生工公司提；Bcl-2 抗體、Bax 抗體、GAPDH 抗體和HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗均購(gòu)于Abcam 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組和處理 AECⅡ由本實(shí)驗(yàn)室分離于健康雄性SD 大鼠，并經(jīng)純化和鑒定。用DMEM/F12 培養(yǎng)基在37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，24 h 后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后備用。將AECⅡ細(xì)胞分為6組：對(duì)照組、肺炎鏈球菌組、miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-449a-5p組（轉(zhuǎn)染miR-449a-5p mimics）、miR-449a-5p+pcDNA3.1 組（轉(zhuǎn)染miR-449a-5p mimics 和pcDNA3.1）和miR-449a-5p+pcDNA3.1-Bax 組（轉(zhuǎn)染miR-449a-5p mimics 和pcDNA3.1-Bax），當(dāng)肺炎鏈球菌組、miR-NC 組、miR-449a-5p 組、miR-449a-5p+pcDNA3.1 組和miR-449a-5p+pcDNA3.1-Bax 組AECⅡ細(xì)胞細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，用濃度為1×108CFU/mL 的肺炎鏈球菌培養(yǎng)AECⅡ細(xì)胞，其中miR-NC組、miR-449a-5p 組、miR-449a-5p+pcDNA3.1 組和miR-449a-5p+pcDNA3.1-Bax 組在肺炎鏈球菌干預(yù)前48 h 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對(duì)照組為正常培養(yǎng)的AECⅡ細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AECⅡ細(xì)胞，按照每孔4×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，按照LipofectamineTM2000 使用說明將miR-NC、miR-449a-5p mimics 分別轉(zhuǎn)染AECⅡ細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為驗(yàn)證miR-449a-5p 是通過調(diào)控Bax 表達(dá)影響肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，將miR-449a-5p mimics 和pcDNA3.1-Bax同時(shí)轉(zhuǎn)染至AECⅡ細(xì)胞。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)miR-449a-5p的表達(dá) 取按照上述分組進(jìn)行處理的各組AECⅡ細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后TRIzol 法提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以U6 為內(nèi)參，qPCR 檢測(cè)并用2-ΔΔCt法計(jì)算各組AECⅡ細(xì)胞中miR-449a-5p的表達(dá)水平。引物序列如下：miR-449a-5p 上游引物5’-GGGTTAAGACTTGCAGT-3’，下游5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6 上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATT-TGCGT-3’。

1.5 ELISA法檢測(cè)IL-6和IL-10含量 取按照上述分組進(jìn)行處理的各組AECⅡ細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清液，參照IL-6 和IL-10 ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書法檢測(cè)IL-6和IL-10含量。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取按照上述分組進(jìn)行處理的各組AECⅡ細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液調(diào)整使細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。每管加入100 μL的AECⅡ細(xì)胞，再向管中加入5 μL的Annexin V-FITC，室溫避光混勻，10 min 后，加入5 μL的PI，室溫避光孵育5 min后，加入PBS至500 μL，輕輕混勻后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 利用生物信息軟件TargetScan 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-449a-5p 與Bax 的3’UTR 之間存在部分互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，猜測(cè)miR-449a-5p 與Bax 存在靶向調(diào)控關(guān)系，并進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建野生型WT-Bax和突變型MUT-Bax的Bax-3’UTR 熒光素酶報(bào)告基因載體，利用LipofectamineTM2000 將miR-449a-5p mimics 和miR-NC分別與WT-Bax 和MUT-Bax 共轉(zhuǎn)染AECⅡ細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，測(cè)定各組AECⅡ細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.8 Western blotting檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

取按照“1.3”項(xiàng)進(jìn)行處理的各組AECⅡ細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后，用RIPA 裂解液于冰上裂解各組細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白。BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白樣品濃度。取適量已煮沸變性蛋白樣品用SDS-PAGE分離細(xì)胞蛋白，電泳完畢后，將細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用Western封閉液搖床封閉60 min，吸盡封閉液后，Western洗滌液洗膜10 min，洗3次后，加入已稀釋的抗Bax 和Bcl-2 抗體室溫孵育2 h，再次用Western洗滌液洗膜3次后，加入已稀釋的Ⅱ抗室溫繼續(xù)孵育1 h，ECL顯影后拍照，以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件分析目的蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺炎鏈球菌對(duì)細(xì)胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 如表1 和圖1 所示，肺炎鏈球菌作用后的AECⅡ細(xì)胞分泌的促炎因子IL-6 含量顯著升高，抗炎因子IL-10含量顯著降低，AECⅡ細(xì)胞的凋亡率顯著增加（P＜0.05）。表明肺炎鏈球菌能夠誘導(dǎo)AECⅡ細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

表1 肺炎鏈球菌對(duì)細(xì)胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 ，n=9

表1 肺炎鏈球菌對(duì)細(xì)胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 ，n=9

圖1 肺炎鏈球菌對(duì)細(xì)胞AECⅡ凋亡的影響

2.2 肺炎鏈球菌對(duì)細(xì)胞AECⅡ中miR-449a-5p表達(dá)的影響 如表2所示，與對(duì)照組相比，肺炎鏈球菌作用后的AECⅡ細(xì)胞miR-449a-5p的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 肺炎鏈球菌對(duì)細(xì)胞AECⅡ中miR-449a-5p表達(dá)的影響 ，n=9

表2 肺炎鏈球菌對(duì)細(xì)胞AECⅡ中miR-449a-5p表達(dá)的影響 ，n=9

2.3 過表達(dá)miR-449a-5p對(duì)肺炎鏈球菌作用的細(xì)胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 如圖2、表3 所示，與miR-NC 組相比，miR-449a-5p 組AECⅡ細(xì)胞中miR-449a-5p 的表達(dá)顯著升高，Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Bax 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，IL-10的分泌量顯著升高，IL-6的分泌量顯著降低，細(xì)胞的凋亡率顯著降低（P＜0.05）。提示，過表達(dá)miR-449a-5p 能夠拮抗肺炎鏈球菌對(duì)AECⅡ細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用，能夠抑制肺炎鏈球菌對(duì)炎癥因子的作用。

圖2 過表達(dá)miR-449a-5p對(duì)肺炎鏈球菌作用的細(xì)胞AECⅡ凋亡蛋白表達(dá)的影響

表3 過表達(dá)miR-449a-5p對(duì)肺炎鏈球菌作用的細(xì)胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 ，n=9

表3 過表達(dá)miR-449a-5p對(duì)肺炎鏈球菌作用的細(xì)胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 ，n=9

2.4 miR-449a-5p 靶向調(diào)控Bax 的表達(dá) 如圖3A所示，miR-449a-5p與WT-Bax的3’UTR之間存在部分互補(bǔ)的核苷酸序列。表4顯示，當(dāng)上調(diào)miR-449a-5p表達(dá)后，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Bax的3’UTR熒光素酶報(bào)告基因載體的AECⅡ細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染MUT-Bax 的3’UTR 熒光素酶報(bào)告基因載體的AECⅡ細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05）。表5 和圖3B 顯示，當(dāng)上調(diào)miR-449a-5p表達(dá)后，AECⅡ細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)顯著降低；當(dāng)下調(diào)miR-449a-5p 表達(dá)后，AECⅡ細(xì)胞Bax 蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。提示，Bax 是miR-449a-5p 的靶基因，miR-449a-5p 可負(fù)性調(diào)控Bax 的表達(dá)。

圖3 miR-449a-5p靶向、調(diào)控Bax

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) ，n=9

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) ，n=9

表5 miR-449a-5p調(diào)控Bax的表達(dá) ，n=9

表5 miR-449a-5p調(diào)控Bax的表達(dá) ，n=9

與miR-NC組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

2.5 過表達(dá)Bax能逆轉(zhuǎn)miR-449a-5p對(duì)肺炎鏈球菌作用的細(xì)胞AECⅡ凋亡及炎性因子的作用 如表6和圖4顯示，與miR-NC組相比，miR-449a-5p組AECⅡ細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Bax蛋白的表達(dá)水平顯著降低，IL-6 的分泌量顯著降低，IL-10的分泌量顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低；與miR-449a-5p+pcDNA3.1組相比，miR-449a-5p+pcDNA3.1-Bax 組AECⅡ細(xì)胞Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高，IL-6的分泌量顯著升高，IL-10 的分泌量顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，過表達(dá)Bax能逆轉(zhuǎn)miR-449a-5p對(duì)肺炎鏈球菌作用的細(xì)胞AECⅡ凋亡及炎性因子的作用。

圖4 過表達(dá)Bax 能逆轉(zhuǎn)miR-449a-5p 對(duì)肺炎鏈球菌作用的細(xì)胞AECⅡ凋亡蛋白表達(dá)的影響

表6 過表達(dá)Bax能逆轉(zhuǎn)miR-449a-5p對(duì)肺炎鏈球菌作用的細(xì)胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 ，n=9

表6 過表達(dá)Bax能逆轉(zhuǎn)miR-449a-5p對(duì)肺炎鏈球菌作用的細(xì)胞AECⅡ凋亡及炎性因子的影響 ，n=9

與miR-NC組比較，*P＜0.05；與miR-449a-5p+pcDNA3.1組比較，#P＜0.05。

3 討論

肺泡上皮細(xì)胞分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞覆蓋肺泡的大部分表面，是氣體交換的部位，AECⅡ分泌表面活化劑降低肺泡表面張力對(duì)穩(wěn)定肺泡大小具有重要意義[4]。Rai 等[5]研究表明，肺炎鏈球菌分泌過氧化氫，引起肺泡上皮細(xì)胞DNA損傷和凋亡，DNA的損傷程度和肺泡上皮細(xì)胞凋亡程度相關(guān)。肺泡上皮細(xì)胞的損傷導(dǎo)致體液不平衡是肺炎發(fā)展中的重要步驟。細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致肺炎發(fā)病機(jī)制中肺泡上皮細(xì)胞防御功能喪失的重要機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌處理AECⅡ細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡率顯著增加，抗炎因子IL-10分泌量顯著降低，促炎因子IL-6分泌量顯著升高（P＜0.05），這與王勇等[6]的研究結(jié)果相一致，表明AECⅡ細(xì)胞凋亡模型構(gòu)建成功。

miR-34/449 家族是一類在進(jìn)化中高度保守的miRNA，在3 個(gè)基因組位點(diǎn)上通常包含6 個(gè)同源基因：miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-449a、miR-449b和miR-449c。miR-449a-5p是近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNA，隸屬于miR-34/449 家族。目前，關(guān)于miR-449a 對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控的研究主要集中惡性腫瘤中。Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-449a在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-449a 可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞G1 期阻滯和細(xì)胞凋亡。Li 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-449a 可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。此外，miR-449a 還可靶向Bcl-2 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡[9]。本研究中，用肺炎鏈球菌處理AECⅡ細(xì)胞后，qPCR檢測(cè)顯示，AECⅡ細(xì)胞中miR-449a-5p 的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。推測(cè)，miR-449a-5p 的表達(dá)下調(diào)與肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。

在肺泡上皮細(xì)胞的凋亡過程中，多種凋亡凋亡相關(guān)蛋白參與其中。促凋亡蛋白Bax 是Bcl-2 家族的主要成員，Bax主要聚集在細(xì)胞質(zhì)中，通過調(diào)控線粒體膜轉(zhuǎn)換孔形成，促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放。隨后細(xì)胞色素C 與凋亡相關(guān)因子Apaf-1 結(jié)合，促使caspase-9 活化，激活caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。而Bcl-2則抑制細(xì)胞色素C釋放，從而發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。細(xì)胞因子在肺炎中扮演重要角色，抗炎因子分泌減少和促炎因子分泌增多導(dǎo)致引起自身組織細(xì)胞損傷和全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生。本研究中，AECⅡ細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-449a-5p mimics后，用肺炎鏈球菌處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AECⅡ細(xì)胞的凋亡率顯著降低，細(xì)胞中Bax 蛋白的表達(dá)和IL-6 含量顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)和IL-10含量顯著升高（P＜0.05）。提示，過表達(dá)miR-449a-5p 可抑制肺炎鏈球菌對(duì)炎癥因子的作用，拮抗肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上細(xì)胞凋亡。

近年來，miRNA通過調(diào)控Bax表達(dá)參與對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控被廣泛報(bào)道。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，人退行性核髓細(xì)胞中Bax 的表達(dá)顯著上調(diào)，miR-573 通過靶向下調(diào)Bax抑制核髓細(xì)胞凋亡是椎間盤退變治療的新型有效策略。Zhou等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-208b通過靶向下調(diào)Bax 表達(dá)保護(hù)H9c2 細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Liu等[13]研究表明，miR-214通過靶向Bax 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡也有阻礙作用。此外，miR-145[14]、miR-477a[15]、miR-339[16]等多種miRNA 都可通過靶向調(diào)控Bax表達(dá)參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Western blot 檢測(cè)證實(shí)miR-449a-5p 可靶向負(fù)性調(diào)控Bax 的表達(dá)。表明miR-449a-5p 通過下調(diào)Bax 表達(dá)拮抗肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡，這與王勇等[17]沉默Bax減弱TNF-α誘導(dǎo)的人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡結(jié)論相吻合。為進(jìn)一步證實(shí)miR-449a-5p是通過下調(diào)Bax表達(dá)進(jìn)而影響肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Bax 能逆轉(zhuǎn)miR-449a-5p 對(duì)肺炎鏈球菌作用對(duì)AECⅡ細(xì)胞凋亡及炎性因子分泌的影響。提示miR-449a-5p通過靶向下調(diào)Bax 表達(dá)減弱肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的AECⅡ細(xì)胞凋亡。

綜上所述，肺炎鏈球菌處理可增加肺泡上皮細(xì)胞促炎因子IL-6 的分泌，減少抗炎因子IL-10 的分泌，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，miR-449a-5p 通過靶向下調(diào)Bax表達(dá)可減弱肺炎鏈球菌對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的影響。本研究的發(fā)現(xiàn)為靶向miR-449a-5p治療肺炎奠定了理論基礎(chǔ)，為肺炎的治療提供新的思路。