陳朝琴，薛治乾，李文霞△

（儋州市人民醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科2.病理科，儋州 571700）

2 型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）是一種常見的慢性代謝性疾病，隨著人們生活方式的改變以及我國人口老齡化，T2D 的發(fā)病率逐年升高[1]。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會的統(tǒng)計，2011年全球糖尿病患者數(shù)量達到3.7 億，到2030 年這一數(shù)字將接近5.5億[2]。高血糖、胰島素抵抗和β細胞功能受損構(gòu)成了T2D 的病理基礎(chǔ)。高血糖會導(dǎo)致β 細胞功能異常，引起胰島素分泌受損和胰島β 細胞凋亡增加等[3]。因此，糖毒性在T2DM 的發(fā)病機理中具有重要作用。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一種短的非編碼調(diào)控RNA 分子，已成為基因調(diào)控的重要參與者，并且對糖尿病的治療過程具有重大影響[4]。研究表明，miRNA 是脂質(zhì)和葡萄糖代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，并且通過影響肝臟、脂肪組織和胰腺的狀態(tài)和功能，在代謝疾病的發(fā)病機理中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-6]。此外，據(jù)報道，許多miRNA參與胰腺發(fā)育，并在胰島素抵抗個體的胰島素分泌和β細胞分化轉(zhuǎn)錄中起轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[7-8]。因此，miRNA有望成為糖尿病的治療新靶點。最近的研究認為，miR-378a是體內(nèi)能量和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑，是改善代謝失調(diào)的潛在靶標(biāo)[9]。但是，miR-378a 是否參與糖毒性誘導(dǎo)的胰島β細胞損傷仍不清楚。本實驗探討miR-378a對高糖介導(dǎo)胰島β 細胞損傷的影響，為T2D 臨床防治和治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

大鼠胰島β 細胞INS-1（美國ATCC）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco）；miR-378a inhibitors 及inhibitors control（上海吉瑪生物）；Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen）；RNA 提取試劑盒、ECL 超敏化學(xué)發(fā)光試劑（賽默飛世爾）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 實時熒光定量PCR 檢測試劑盒（日本TOYOBO）；MTT 試劑、DCFH-DA熒光探針、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（美國Sigma）；LDH 和MDA 檢測試劑盒（南京建成生物）；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（日本TaKaRa）；胰島素檢測試劑盒（上海紀(jì)寧生物）；Cleaved Caspase 3 單抗（美國Abcam）；HRP 標(biāo)記的IgG（美國CST）。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組

INS-1 細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進行常規(guī)培養(yǎng)，每隔1 d 更換1 次新的培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期的INS-1 細胞以不同的處理方式進行分組：Con組（采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的INS-1細胞）、HG組（采用25 mmol/L 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的INS-1 細胞）、HG+anti-miR-NC組（采用25 mmol/L高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的INS-1細胞+轉(zhuǎn)染inhibitors control）和HG+antimiR-378a 組（采用25 mmol/L 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的INS-1 細胞+轉(zhuǎn)染miR-378a inhibitors）。采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑使用說明操作，其中inhibitors control和miR-378a inhibitors 的轉(zhuǎn)染濃度均為100 nmol/L。以上各組INS-1細胞處理后于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，48 h 后分別收集各組INS-1 細胞及上清培養(yǎng)液進行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.3 實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)測定細胞中miR-378a的相對表達量

各組INS-1 細胞處理48 h 后，分別收集各組INS-1細胞，加入適量TRIzol試劑分別提取總RNA，取2 μL RNA 樣品檢測RNA 的純度和濃度，合格的RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，獲得的cDNA 為模板鏈，U6為內(nèi)參，采用SYBR Green實時熒光定量PCR檢測試劑盒進行擴增，檢測miR-378a 的相對表達量。miR-378a 引物（上游5’-GGGCACTGGACTTGGAGTC-3’，下游5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’）；U6（上游5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’）。擴增程序設(shè)為：94 ℃5 min，隨后設(shè)40 個循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s。待反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)樣本的Ct值，采用2-△△Ct法分析各組INS-1細胞中miR-378a的相對表達量。

1.4 MTT實驗檢測細胞活力

生長良好的INS-1 細胞以1×105個/mL 的密度接種于96孔板內(nèi)，按照“1.2”項進行分組處理，同時設(shè)置調(diào)零孔，48 h后分別向每孔細胞中加入MTT溶液100 μL，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，取出細胞，去細胞培養(yǎng)液，再向細胞中加入150 μL 二甲基亞砜，于震蕩儀上振蕩10 min，待結(jié)晶沉淀全部溶解后，調(diào)整多功能酶標(biāo)儀波長至450 nm，測定各組INS-1 細胞的吸光度值（A 值），將對照組INS-1 細胞活力記為100%，分別計算其余各組INS-1細胞的活力。

1.5 DCFH-DA熒光探針法檢測ROS水平

INS-1 細胞接種到6 孔板中，按照“1.2”項的方法分組處理48 h 后，除去上清培養(yǎng)液，向細胞中加入含DCFH-DA 熒光探針的無血清培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)30 min，期間輕柔晃動2次，取出細胞培養(yǎng)板，以PBS洗滌細胞，除去探針和培養(yǎng)液，加入適量PBS重懸細胞，使用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm 處分析熒光強度，以熒光強度表示ROS水平。

1.6 LDH和MDA含量檢測

INS-1 細胞分組處理48 h 后，分別收集細胞上清培養(yǎng)液，除去細胞碎片，使用LDH和MDA含量檢測試劑盒分別測定上清液中LDH 和MDA 含量，具體步驟參考試劑盒使用說明。

1.7 ELISA實驗檢測細胞分泌胰島素水平

INS-1細胞分組處理48 h后，收集細胞上清液，參照ELISA檢測試劑盒說明書分析各組INS-1細胞分泌胰島素水平，具體操作步驟嚴格參照胰島素檢測試劑盒說明書進行。

1.8 流式細胞術(shù)測定細胞凋亡情況

收集處理48 h后的4組INS-1細胞，PBS洗滌細胞3次，向細胞中加入適量結(jié)合緩沖液，制成濃度為1×106個/mL的細胞懸液，再加入AnnexinⅤ-FITC和PI 染液各5 μL，輕輕混勻，室溫下避光染色15 min，加入結(jié)合緩沖液后立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.9 Western blotting 實驗檢測Cleaved Caspase 3蛋白表達

INS-1 細胞分組處理結(jié)束后，去上清培養(yǎng)液，PBS洗滌數(shù)次，加入適量細胞裂解液，冰上裂解細胞并提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，取30 μg 蛋白上樣，配制10%的SDSPAGE 凝膠，電泳分離蛋白并電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，在含5%脫脂奶粉封閉液中封阻2 h，洗膜后加入稀釋的一抗（1∶800稀釋），4 ℃過夜孵育，取出膜后洗膜，再加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫反應(yīng)2 h，洗膜后滴加ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，顯影、定影，曝光并采集圖像，使用Image J 軟件分析各組INS-1 細胞中Cleaved Caspase 3 蛋白相對表達水平，以Cleaved Caspase 3蛋白條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組INS-1細胞中miR-378a表達情況比較

與Con組相比，HG組INS-1細胞中miR-378a的表達量明顯升高（P＜0.05），細胞活力明顯降低（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+anti-miR-378a 組INS-1 細胞中miR-378a 的表達量明顯降低（P＜0.05），細胞活力明顯升高（P＜0.05），而HG+antimiR-NC組中miR-378a的表達量和細胞活力無顯著改變（P＞0.05），見表1。提示高糖刺激能夠促進胰島β 細胞中miR-378a 的表達，而轉(zhuǎn)染miR-378a inhibitors 能夠有效抑制高糖刺激的miR-378a 的表達升高，且高糖刺激能夠抑制胰島β細胞活力，而抑制miR-378a能夠逆轉(zhuǎn)高糖刺激引起的細胞活力降低。

表1 各組INS-1細胞miR-378a相對表達量和細胞活力比較 ，n=3

表1 各組INS-1細胞miR-378a相對表達量和細胞活力比較 ，n=3

與Con組比較，*P＜0.05；與HG組比較，&P＜0.05。

2.2 各組INS-1細胞氧化損傷情況比較

與Con組相比，HG組INS-1細胞內(nèi)ROS水平明顯升高，LDH 漏出量和上清液中MDA 含量明顯增多（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+anti-miR-378a 組INS-1 細胞內(nèi)ROS 水平明顯降低，LDH 漏出量和上清液中MDA 含量明顯減少（P＜0.05），而HG+antimiR-NC組ROS水平、LDH漏出量及上清液中MDA含量均無明顯改變（P＞0.05），見表2。提示高糖刺激能夠引起胰島β 細胞氧化損傷，而抑制miR-378a能夠減輕高糖引起的胰島β細胞的氧化損傷。

表2 各組INS-1細胞內(nèi)ROS水平及上清液中LDH 和MDA的含量比較 ，n=3

表2 各組INS-1細胞內(nèi)ROS水平及上清液中LDH 和MDA的含量比較 ，n=3

與Con組比較，*P＜0.05；與HG組比較，&P＜0.05。

2.3 各組INS-1細胞分泌胰島素水平比較

與Con組相比，HG組INS-1細胞中胰島素水平明顯降低（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+anti-miR-378a 組INS-1 細胞中胰島素水平明顯升高（P＜0.05），而HG+anti-miR-NC 組中胰島素水平無明顯改變（P＞0.05），見表3。提示高糖刺激能夠抑制胰島β細胞分泌胰島素，而抑制miR-378a能夠逆轉(zhuǎn)高糖刺激對胰島β細胞分泌胰島素的抑制作用。

表3 各組INS-1細胞胰島素水平比較 ，n=3

表3 各組INS-1細胞胰島素水平比較 ，n=3

與Con組比較，*P＜0.05；與HG組比較，&P＜0.05。

2.4 各組INS-1細胞凋亡情況比較

與Con 組相比，HG 組INS-1細胞凋亡率和Cleaved Caspase 3 的表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與HG組相比，HG+anti-miR-378a組INS-1細胞凋亡率和Cleaved Caspase 3的表達水平均明顯降低（P＜0.05），而HG+anti-miR-NC 組細胞凋亡率和Cleaved Caspase 3 的表達水平均無明顯改變（P＞0.05），見圖1和表4。表明高糖刺激能夠促進胰島β細胞凋亡，而抑制miR-378a能夠逆轉(zhuǎn)高糖刺激對胰島β細胞凋亡促進作用。

圖1 miR-378a介導(dǎo)高糖刺激對胰島β細胞凋亡的影響

表4 各組INS-1 細胞凋亡率和Cleaved Caspase 3 的表達水平比較 ，n=3

表4 各組INS-1 細胞凋亡率和Cleaved Caspase 3 的表達水平比較 ，n=3

與Con組比較，*P＜0.05；與HG組比較，&P＜0.05。

3 討論

據(jù)估計，2015年全球有超過4.15億人患有糖尿病，其發(fā)病率和死亡率不斷增加[10]。所有糖尿病病例中約95%為T2D。T2D 是一種以胰島素抵抗和胰島β細胞功能缺陷為特征的代謝紊亂疾病[11]。實驗報告稱，β 細胞的損傷是糖尿病的重要病理基礎(chǔ)。營養(yǎng)對于維持β細胞功能至關(guān)重要，但是，過多的營養(yǎng)素（例如葡萄糖）會誘導(dǎo)對β 細胞功能的損傷[12-13]。LDH含量的高低在一定程度上反應(yīng)細胞膜的完整性，LDH漏出量越高表明細胞損傷程度越嚴重。氧化應(yīng)激在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用，它可以通過檢測細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，MDA水平和SOD活性來評估。在本研究中，高濃度的葡萄糖培養(yǎng)液孵育胰島β 細胞INS-1能夠顯著降低細胞活力，增加細胞凋亡率，提高細胞內(nèi)ROS 水平，增加LDH 的漏出量及上清液中MDA 的含量，降低胰島素分泌水平，提示高糖能夠抑制胰島β細胞活力，促進細胞凋亡，引起細胞氧化損傷并阻礙胰島素的分泌。這些研究結(jié)果與以往研究相符，表明高糖刺激能夠誘發(fā)胰島β細胞發(fā)生損傷。

miRNA 是一組內(nèi)源性非編碼小RNA，長度在21至23個核苷酸之間，是轉(zhuǎn)錄后基因表達的關(guān)鍵調(diào)控因子。研究表明，miRNA 與T2D 的發(fā)病機理有關(guān)[14]。更重要的是，miRNA可通過影響胰腺調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖代謝的狀態(tài)和功能，在代謝疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15-16]。在miRNA 中，據(jù)報道m(xù)iR-378a 在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝中發(fā)揮重要作用[17]。Sud等[19]在對高果糖飲食改變的miRNA進行了全面研究，發(fā)現(xiàn)包括miR-378a 在內(nèi)的多種miRNA 在慢性代謝疾病發(fā)病機理中的重要性[18]。Mo 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，降糖消渴顆粒治療能夠降低糖尿病小鼠胰腺組織中miR-378a 表達，進而發(fā)揮抗糖尿病的作用。最近的研究表明，miR-378a參與胰島素抵抗的發(fā)病機理，對β細胞功能非常重要。但是，尚未完全了解miR-378a對高糖誘導(dǎo)的糖毒性的確切作用。因此，本實驗檢測了高糖刺激的胰島β 細胞中miR-378a的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖能夠促進miR-378a的表達，提示miR-378a 可能參與高糖刺激對胰島β 細胞的損傷。此外，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-378a 能夠明顯減少高糖誘導(dǎo)的INS-1 細胞凋亡，減輕氧化損傷，提高胰島素分泌水平。表明miR-378a 可保護INS-1細胞免受高糖誘導(dǎo)的糖毒性。以往大量研究顯示，miRNA通常是通過調(diào)控下游靶基因的表達從而發(fā)揮生物學(xué)功能，且已有多篇文獻報道了miR-378a 在腫瘤、新陳代謝、線粒體和自噬中的生物學(xué)功能和作用機制[20-22]。miR-378a對高糖刺激的INS-1細胞的保護作用可能通過靶向下游基因或信號通路發(fā)揮作用，后續(xù)研究將對此進行探究。

綜上，高糖刺激能夠促進INS-1 細胞中miR-378a 的表達，抑制miR-378a 能夠逆轉(zhuǎn)高糖刺激對INS-1細胞的損傷，減輕氧化損傷和凋亡。