李雅菲，張 燕，董清科，汪代杰

（四川省瀘州市人民醫(yī)院腫瘤科，瀘州 646000）

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，是由吸煙、環(huán)境和遺傳因素之間相互作用引起的，根據(jù)肺癌的組織學(xué)類別，其可分為肺腺癌、小細(xì)胞肺癌、大細(xì)胞肺癌和鱗狀細(xì)胞肺癌，其中肺腺癌的發(fā)病率最高[1-2]。目前臨床對(duì)肺腺癌的治療效果不理想，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期或已發(fā)生不同程度的局部浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，而即使采用放療、化療等治療方法，晚期患者生存率仍然較低[3-4]。因此，對(duì)肺腺癌發(fā)病的分子機(jī)制深入研究，尋找新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性小分子非編碼RNA，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，在包括肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)過程[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-337在肺癌組織中低表達(dá)，上調(diào)miR-337表達(dá)水平可顯著抑制肺癌的發(fā)生[6]，但其具體機(jī)制尚未完全清楚。因此，本研究旨在觀察miR-337對(duì)PG49人肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B（貨號(hào)H084）購(gòu)自上海舜冉生物科技有限公司；人肺腺癌PG49 細(xì)胞（貨號(hào)Y-02117）購(gòu)自上海富恒生物科技有限公司。miR-337 mimic 慢病毒（LVmiR-337 mimic）、miR-337 陰性對(duì)照（NC）慢病毒空載體（LV-NC）由上海吉?jiǎng)P基因有限公司設(shè)計(jì)并合成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）引物由上海吉瑪生物公司設(shè)計(jì)合成；PCR試劑盒（貨號(hào)14966005）購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)K1622）購(gòu)自美國(guó)Fermentas 公司；Trizol（貨號(hào)46301）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；兔抗人單克隆Ki67 抗體（貨號(hào)ab92742)、鼠抗人單克隆E-鈣粘蛋白（E-cadherin）抗體（貨號(hào)ab11512）、兔抗人多克隆基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）抗體（貨號(hào)ab97779)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；鼠抗人單克隆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）抗體（貨號(hào)9139）、兔抗人單克隆p-STAT3抗體（貨號(hào)9145）、鼠抗人單克隆Janus 激酶2（JAK2）抗體（貨號(hào)74987）、兔抗人多克隆p-JAK2抗體（貨號(hào)3771）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) BEAS-2B 和PG49 細(xì)胞用RPMI-1640 培養(yǎng)基（含10%FBS、100μg/mL 鏈霉素和100 U/mL青霉素），置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。隔天換液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)用0.25%腺酶消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 將PG49細(xì)胞以1×106個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于24 孔板，每孔200 μL，分為空白對(duì)照組（不轉(zhuǎn)染）、LV-NC 組和LV-miR-337 mimic 組，另以BEAS-2B細(xì)胞作為正常組，每組8個(gè)復(fù)孔。取2 支EP 管，分別加入200 μL 完全培養(yǎng)基，LV-NC 組和LV-miR-337 mimic 組分別加入24 μL 濃度為1×108TU/mL 慢病毒空載體和慢病毒液（轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)MOI值為60），混合均勻后各加入4 μL濃度為6 μg/mL 聚凝胺。正常組、空白對(duì)照組均加入228 μL PBS。各組細(xì)胞均置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 qPCR 法檢測(cè)人肺腺癌PG49 細(xì)胞miRNA-337表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，Trizol 法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度和純度，將RNA 轉(zhuǎn)錄為cDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ABI 9700）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2－△△Ct法計(jì)算miRNA-337 相對(duì)表達(dá)量。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：miR-337上游：5’-CGCTTCAGCTCCTATATGA-3’，下游：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內(nèi)參U6 上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.5 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 以2×104個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔200 μL，分別在24 h、48 h、72 h 加入CKK8 試劑，按照CKK8 試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD）值。細(xì)胞增殖率=轉(zhuǎn)染組OD 值/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人肺腺癌PG49細(xì)胞侵襲

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，在Transwell 小室下層加入10% FBS 培養(yǎng)基500 μL，上層加入100 μL 細(xì)胞懸液，每組設(shè)8 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室細(xì)胞，預(yù)冷甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色40 min。棄上、下室培養(yǎng)基，在倒置相差顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算侵襲率。侵襲率=實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)/空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人肺腺癌PG49細(xì)胞遷移

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，收集各組細(xì)胞調(diào)整密度為2.5×105個(gè)/mL，每孔2 mL 接種于6 孔板，用200 μL 無(wú)菌槍頭于6 孔板底部垂直劃痕，確保每個(gè)孔內(nèi)劃痕寬度一致，PBS清洗3次，繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h，顯微鏡下觀察、拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率＝（0 h劃痕區(qū)域?qū)挾龋恼諘r(shí)間劃痕區(qū)域?qū)挾?/0 h劃痕寬度×100%。

1.8 Western blotting法檢測(cè)JAK2/STAT3通路、Ki-67、MMP-9、E-cadherin 蛋白表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，PBS 清洗，加入含PMSF 的RIPA 裂解液置冰上裂解10 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，提取蛋白，BCA 法測(cè)定各組蛋白濃度，按4∶1 體積比加入5×上樣緩沖液，煮沸使蛋白變性，預(yù)先制備6%分離膠和5%濃縮膠，取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入一抗JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Ki-67、MMP-9、E-cadherin（均1∶500）4 ℃冰箱孵育過夜，TBST清洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000，蘭州維科生物工程有限責(zé)任公司），室溫孵育2 h，TBST 清洗，ECL 發(fā)光、曝光、顯影。采用Image J 軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞miR-337相對(duì)表達(dá)量比較 與正常組（1.20±0.29）比較，空白對(duì)照組miR-337 相對(duì)表達(dá)量（0.78±0.25）、LV-NC 組miR-337 相對(duì)表達(dá)量（0.77±0.24）均顯著降低（P＜0.05）；與空白對(duì)照組、LV-NC組比較，LV-miR-337 mimic 組miR-337 相對(duì)表達(dá)量（1.59±0.31）顯著升高（P＜0.05）。

2.2 過表達(dá)miR-337對(duì)人肺腺癌PG49細(xì)胞增殖的影響 與空白對(duì)照組、LV-NC 組比較，LV-miR-337 mimic組細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 3組人肺腺癌PG49細(xì)胞增殖率比較

表1 3組人肺腺癌PG49細(xì)胞增殖率比較

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與LV-NC組比較，#P＜0.05。

2.3 過表達(dá)miR-337對(duì)人肺腺癌PG49細(xì)胞侵襲能力的影響 與空白對(duì)照組、LV-NC組比較，LV-miR-337 mimic組細(xì)胞侵襲率顯著降低（P＜0.05），見圖1、表2。

表2 3組人肺腺癌PG49細(xì)胞侵襲能力比較

表2 3組人肺腺癌PG49細(xì)胞侵襲能力比較

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與LV-NC組比較，#P＜0.05。

圖1 各組人肺腺癌PG49細(xì)胞的細(xì)胞侵襲情況（200×）

2.4 過表達(dá)miR-337對(duì)人肺腺癌PG49細(xì)胞遷移率的影響 與空白對(duì)照組比較、LV-NC 組比較，LVmiR-337 mimic 組細(xì)胞遷移率顯著降低（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 3組人肺腺癌PG49細(xì)胞遷移率比較

表3 3組人肺腺癌PG49細(xì)胞遷移率比較

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與LV-NC組比較，#P＜0.05。

圖2 各組人肺腺癌PG49細(xì)胞遷移情況（200×）

2.5 過表達(dá)miR-337 對(duì)PG49 細(xì) 胞p-JAK2、p-STAT3、Ki-67、MMP-9、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組、LV-NC 組比較，LV-miR-337 mimic組細(xì)胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值及Ki-67、MMP-9蛋白表達(dá)量均顯著降低（均P＜0.05），而E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見圖3、表4。

圖3 Western blotting蛋白電泳圖

表4 3組PG49細(xì)胞Ki-67、MMP-9、E-cadherin、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)量比較

表4 3組PG49細(xì)胞Ki-67、MMP-9、E-cadherin、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)量比較

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與LV-NC組比較，#P＜0.05。

3 討論

肺腺癌是肺癌常見的分型，近年來肺腺癌的發(fā)病率和死亡率呈上升的趨勢(shì)，該病早期特征不明顯，癌細(xì)胞易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，預(yù)后情況不理想，近年來肺腺癌的研究重點(diǎn)已從傳統(tǒng)治療轉(zhuǎn)向腫瘤分子特性的靶向治療[7-8]。miRNA 是一類長(zhǎng)度約為18～22個(gè)核苷酸分子的非編碼RNA，可與靶基因特定位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)約60%人類蛋白編碼基因，大量研究表明，人類癌癥的發(fā)生與miRNA 異常表達(dá)密切相關(guān)[9]。miR-337 位于14q32.2 號(hào)染色體，研究顯示，miR-337 在肺癌組織中表達(dá)降低，其異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生有關(guān)[6,10]。本研究通過qPCR對(duì)人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 和人肺腺癌PG49 細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與正常組比較，空白對(duì)照組、LV-NC 組細(xì)胞中miR-337相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），表明miR-337在人肺腺癌PG49細(xì)胞中低表達(dá)，可能作為抑癌基因參與肺腺癌發(fā)生發(fā)展。為進(jìn)一步探究miR-337的作用，本研究采用miR-337 mimic 轉(zhuǎn)染人肺腺癌PG49 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組、LV-NC 組比較，LV-miR-337 mimic 組細(xì)胞中miR-337 相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），提示miR-337過表達(dá)模型建立成功。

細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征，也是影響患者預(yù)后的重要原因之一。Ki-67 是影響細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，在細(xì)胞周期中可被檢測(cè)到，目前已廣泛用于細(xì)胞增殖活性的標(biāo)記蛋白[11]。細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解主要由MMPs參與，MMP-9 作為MMPs 家族的重要成員，可降解細(xì)胞基底膜中的Ⅳ型膠原，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移中具有重要作用[12]。E-cadherin 可介導(dǎo)細(xì)胞間相互粘附，穩(wěn)定細(xì)胞骨架，維持細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)，在細(xì)胞粘附和運(yùn)動(dòng)中起重要作用，腫瘤細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)下調(diào)有利于細(xì)胞發(fā)生侵襲遷移[13]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-337通過直接靶向特異性蛋白1抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[14]；Zhuang 等[15]研究表明，MiR-337-3p高表達(dá)可抑制腎癌細(xì)胞增殖、集落生長(zhǎng)和侵襲，增強(qiáng)細(xì)胞粘附；Cao[16]研究表明，miR-337-3p 在宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-337-3p可能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組、LV-NC組比較，LV-miR-337 mimic 組PG49 細(xì)胞的相對(duì)增殖率、侵襲率、遷移率及Ki-67、MMP-9 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，而Ecadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），提示miR-337 過表達(dá)可下調(diào)Ki-67、MMP-9 表達(dá)，上調(diào)Ecadherin 的表達(dá)，進(jìn)而抑制人肺腺癌PG49 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

JAK2/STAT3 信號(hào)通路可參與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)過程。JAK2 被磷酸化后發(fā)生活化，可催化STAT3 磷酸化活化，促進(jìn)p-STAT3 由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因特定的DNA啟動(dòng)子結(jié)合，從而調(diào)節(jié)下游Ki-67、MMP9、E-cadherin 等基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)過程[17-18]。Wei 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-375 可靶向調(diào)控JAK2/STAT3 信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。Zuo等[20]研究顯示，miR-337-3p通過靶向JAK2調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Xia等[21]研究表明，miR-337過表達(dá)可使皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖減少，凋亡水平增加。而目前關(guān)于miR-337在人肺腺癌中相關(guān)研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組、LV-NC組比較，LV-miR-337 mimic 組PG49 細(xì)胞中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），提示miR-337過表達(dá)可抑制JAK2和STAT3磷酸化，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路活化。

綜上所述，miR-337可能通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路，抑制人肺腺癌PG49 細(xì)胞的增殖、遷移，可能為臨床治療人肺腺癌提供新思路。本研究的不足之處在于miR-337 調(diào)節(jié)人肺腺癌PG49 細(xì)胞的增殖、遷移的抑制作用機(jī)制可能涉及其他通路，具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。