劉 黎，楊 帆，張 匠，冷 嬌，劉雪梅，王曉華，梁 龍，董華瓊△

（1.四川省遂寧市中心醫(yī)院，遂寧 629000；2.四川省腫瘤醫(yī)院，成都 610041）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床最常見的消化道惡性腫瘤之一，近期資料顯示，在全球范圍內(nèi)，隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變，CRC的發(fā)病率和致死率呈逐年上升趨勢[1-2]。CRC 占惡性腫瘤第3 位，其主要的致死因素是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。盡管早期的CRC患者通過外科手術(shù)后5 年內(nèi)的生存率有所提高，但是中晚期的CRC患者往往預(yù)后較差，長期生存率較低[4]。目前，放射治療是CRC的主要治療方式之一，但是治療過程中放療抵抗的存在，嚴(yán)重的影響了放療效果。因此，進(jìn)一步探索CRC 的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，從而尋找抑制放療抵抗的新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。miRNAs 是一類22～25 nt 內(nèi)源性的非編碼的單鏈小分子RNA，通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來發(fā)揮生物學(xué)作用[5]。miRNAs與惡性腫瘤密切相關(guān)，可調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，并且miRNA-155在CRC組織中的表達(dá)相比于癌旁組織顯著上升，提示可能參與CRC 的發(fā)生發(fā)展過程[7]。但是目前尚未見研究報(bào)道闡明miRNA-155 的異常表達(dá)對CRC細(xì)胞放射敏感性的影響。因此，本研究主要探究miRNA-155對CRC細(xì)胞SW620放射敏感性的影響及其作用機(jī)制，旨在為臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

CRC 細(xì)胞SW620（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）；RPMI 1640培養(yǎng)基和胚牛血清（美國Hyclone公司）；CCK8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；LipofectamineTM2000（美國Invitrogen 公司）；anti-miRNA-155 and anti-miRNA-155 negative control(吉瑪生物技術(shù)有限公司)；qRT-PCR 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；HIF-1、VEGF 山羊抗兔二抗（中國賽默飛世爾科技有限公司）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（中國賽默飛世爾科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（蘇州凈化設(shè)備制造廠）；醫(yī)用高能電子直線加速器（美國Varian 公司）；凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（德國SensoQuest Lab Cycler 公司）；流式細(xì)胞儀（BECKMAN）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用RPMI 1640培養(yǎng)基（包含10%胚牛血清和1%青霉素/鏈霉素）于37 ℃，5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)SW620細(xì)胞。每隔24 h換液1次，細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)均取對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用對數(shù)生長期SW620 細(xì)胞接種于6 孔板中（2×105個(gè)/每孔），培養(yǎng)至細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)，參照LipofectamineTM2000 說明書將anti-miRNA-155、anti-miRNA-155 NC 轉(zhuǎn)染至SW620 細(xì)胞中，并標(biāo)記為anti-miR-155 組和NC 組。轉(zhuǎn)染6 h 后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞采用qRTPCR 檢測細(xì)胞中miRNA-155 的表達(dá)用來評價(jià)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.4 細(xì)胞電離輻射

轉(zhuǎn)染后的SW620 細(xì)胞用6 MV-X 射線，醫(yī)用高能電子直線加速器進(jìn)行照射，照射源距離為100 cm，劑量率為2 Gy/min，給予劑量為4.0 Gy。細(xì)胞培養(yǎng)瓶下方加1 cm厚的有機(jī)玻璃板，上方覆蓋1 cm厚的膠體。

1.5 CCK8分析檢測細(xì)胞活力

將100 μL 轉(zhuǎn)染后的SW620 細(xì)胞懸液（5×104個(gè)/mL）接種于96孔板，于37 ℃，5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞完全貼壁，6 MV-X 射線處理細(xì)胞。處理后各組細(xì)胞正常條件下培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μL CCK8 溶液，混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔的吸光度（OD值）。

1.6 qRT-PCR分析

按照總RNA 提取試劑盒說明書步驟提取SW620細(xì)胞的總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miRNA-155、內(nèi)參U6引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，序列如下：miRNA-155 上游引物為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’，下游引物為5’-TATTCGCACTGGATACGACCCCCTA-3’；內(nèi)參U6 上游引物為5’-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。取PCR 上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板cDNA 1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，RNase free water 7 μL 配置成總體積為20 μL的反應(yīng)體系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，兩步法程序?yàn)椋?4 ℃2 min(預(yù)變性),94 ℃10 s(變性)、60 ℃30 s(退火)、72 ℃30 s(延伸),共35 個(gè)循環(huán)。用2-△△CT檢測miRNA-155 的表達(dá)水平。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測放射生物學(xué)參數(shù)

轉(zhuǎn)染后的SW620 細(xì)胞用胰蛋白酶消化，重懸，細(xì)胞濃度稀釋至5×103個(gè)/mL接種于6孔板中，37 ℃培養(yǎng)過夜。以0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy的6 MVX射線垂直照射各組細(xì)胞，照射結(jié)束后，于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～15 d，至出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用4%甲醛固定15 min，姬姆薩染液染色30 min，棄去染液后顯微鏡下觀察，并以細(xì)胞集落≥50 作為有效克隆?？寺⌒纬陕剩≒E）以(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%表示，各組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)（SF）根據(jù)公式：存活分?jǐn)?shù)(SF)=克隆數(shù)/(PE×接種細(xì)胞數(shù))進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)GraphPad Prime7.0 軟件構(gòu)建多靶單擊模型擬合細(xì)胞劑量存活曲線，計(jì)算放射生物學(xué)參數(shù)：平均致死量（D0）、準(zhǔn)閾劑量（Dq）、照射劑量2 Gy下細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF2）和放射增敏比（SER）。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染后的SW620細(xì)胞電離輻射，用胰蛋白酶消化后重懸，稀釋至細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，吸取1 mL接種于6孔板中，放置在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿后，用無菌的200 μL槍頭在6孔板中央輕輕劃過，接著用滅菌的PBS 清洗細(xì)胞，加入1 mL 無血清培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。取0 h、24 h分別在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.9 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲

將轉(zhuǎn)染后經(jīng)電離輻射的SW620 細(xì)胞用胰酶消化，加入無血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基制備成濃度為3×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，吸取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell 上室，下室每孔加入600 μL 含10% FBS的RPMI 1640 培養(yǎng)基，放入37 ℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦去上層未遷移的細(xì)胞，滅菌的PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色15 min。顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)，這些視野中細(xì)胞的平均值為Transwell 小室細(xì)胞遷徙的細(xì)胞數(shù)目。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

SW620 細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miRNA-155 和anti-miRNA-155 NC后，使用6 MV-X射線照射細(xì)胞，正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化，用2 mL1×Banding Buffer 稀釋成細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液。取100 μL 加入滅菌的1.5 mL EP 管中，然后加入5 μL AnnexinⅤ-FITC 和10 μL PI，室溫下避光溫育15 min。使用流式細(xì)胞儀檢測各組樣品，分析并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡數(shù)。

1.11 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

采用雙熒光素酶報(bào)告基因分析，進(jìn)一步證實(shí)了miR-155與目標(biāo)基因HIF-1α 3’-UTR的結(jié)合。將含有HIF-1α的3’-UTR的野生型或突變型片段克隆到psiCHECKTM-2 載體（美國Promega）中，形成Luc-WT-3’-UTR載體或Luc-MUT-3’-UTR載體。然后，將miR-155mimics 或其對照（mimics NC）和熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染到SW620細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后檢查熒光素酶活性。

1.12 Western blotting檢測

用RIPA 裂解液提取轉(zhuǎn)染后放射處理的SW620細(xì)胞的總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將變性蛋白以40 μg/每孔上樣至10%SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離蛋白，將分離的蛋白樣品電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜后，將PVDF 膜放入含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h，接著加入稀釋好的GAPDH、HIF-1α、VEGF 一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜。然后再加入稀釋的山羊抗兔二抗（1∶4 000）室溫下孵育1 h。按照ECL試劑盒說明書配制發(fā)光液，用Bio-Rad成像儀顯影。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞中miRNA-155的表達(dá)下調(diào)

SW620 細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miRNA-155 和anti-miRNA-155 NC后，用qRT-PCR檢測miRNA-155的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染anti-miRNA-155 后SW620 細(xì)胞中miRNA-155的表達(dá)水平（0.35±0.11）相比于NC組（0.98±0.05）顯著降低（t=9.13，P＜0.05)；而對照組與NC組相比，miRNA-155的表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組細(xì)胞中miRNA-155的表達(dá)水平比較

2.2 放射線照射后miRNA-155對SW620細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)的影響

使用6MV-X射線對轉(zhuǎn)染后的SW620細(xì)胞進(jìn)行放射處理，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)，其相關(guān)參數(shù)，見表1。與NC組相比，anti-miRNA-155 組細(xì)胞的D0值、Dq值、SF2值顯著降低（P＜0.05），放射增敏比SER 為1.67±0.75?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)miRNA-155能明顯增強(qiáng)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞的放射敏感性。

表1 各組SW620細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)比較

表1 各組SW620細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)比較

2.3 下調(diào)miRNA-155對放射線照射后SW620細(xì)胞的增殖能力的影響

CCK8 檢測結(jié)果顯示，anti-miRNA-155 組直腸癌SW620細(xì)胞增殖能力在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于NC組（t24h=3.319、t48h=5.124、t72h=8.141，P＜0.05），見圖2。

圖2 anti-miRNA-155對SW620細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 下調(diào)miRNA-155對放射線照射后SW620細(xì)胞的遷移能力的影響

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測放射線照射后SW620 細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示，與NC 組相比，anti-miRNA-155 組SW620 細(xì)胞愈合率顯著降低（t=4.708，P＜0.01），見圖3。

2.5 下調(diào)miRNA-155對放射線照射后SW620細(xì)胞的侵襲能力的影響

使用Transwell 小室法檢測放射線照射后SW620 細(xì)胞的侵襲能力。與NC 組相比，anti-miRNA-155 組SW620 細(xì)胞穿越Matrigel 膠的能力受到抑制，細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯減少（t=6.007，P＜0.01），見圖4。

圖4 下調(diào)miRNA-155對SW620細(xì)胞侵襲能力的影響

2.6 下調(diào)miRNA-155促進(jìn)放射線照射后的SW620細(xì)胞凋亡

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)miRNA-155 對電離輻射處理的SW620 細(xì)胞凋亡的影響。放射線照射后anti-miRNA-155組和NC組中細(xì)胞的凋亡率分別為(8.96±0.39)%和(2.28±0.16)%，見圖5A。與NC 組相比較，anti-miRNA-155組SW620細(xì)胞凋亡率顯著上升（t=15.73，P＜0.01），見圖5B。

圖5 下調(diào)miRNA-155對SW620細(xì)胞凋亡的影響

2.7 miRNA-155靶向調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)

通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miRNA-155與HIF-1α的3’-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖6A。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果表明，miRNA-155mimics顯著降低HIF-1α 的WT-3’-UTR 的熒光素酶活性，但不降低突變型的，圖6B。

圖6 miRNA-155靶向HIF-1α

2.8 下調(diào)miRNA-155 對SW620 細(xì)胞中HIF-1α 和VEGF水平的影響

采用Western blotting檢測技術(shù)分析電離輻射的SW620細(xì)胞中HIF-1α 和VEGF表達(dá)水平。經(jīng)過6MV-X 射線照射24 h后，anti-miRNA-155組SW620細(xì)胞中HIF-1α 和VEGF 表達(dá)水平顯著低于NC 組，見圖7。

圖7 下調(diào)miR-155對SW620細(xì)胞中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

CRC是一種高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其具有浸潤性生長、惡性程度高、容易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，導(dǎo)致治療后患者總體生存率極低[8-9]。因此，探究CRC的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)抑制放射耐受的新治療靶點(diǎn)迫在眉睫。miRNAs可調(diào)節(jié)促癌基因或抑癌基因參與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等過程，其可作為腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物和靶向治療的特異性靶點(diǎn)[10-12]。已有研究報(bào)道，miRNA-155 在多種腫瘤組織中異常高表達(dá)，提示可能作為癌基因促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[13]。有研究報(bào)道，miRNA-155參與調(diào)控乳腺癌、腎癌等癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14-15]。此外，2 Gy 射線輻射人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h 時(shí)可顯著增加miRNA-155 的表達(dá)，miRNA-155 與細(xì)胞輻射耐受性密切相關(guān)[16]。但是目前還少有相關(guān)研究闡明miRNA-155 調(diào)控CRC 細(xì)胞的遷移、侵襲和放射耐受性的分子機(jī)制。本研究通過電離輻射轉(zhuǎn)染anti-miRNA-155的SW620細(xì)胞，利用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞放射生物參數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miRNA-155 后SW620 細(xì)胞的D0值、Dq值、SF2值均顯著降低，SER為1.67±0.75。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)miRNA-155 可降低SW620 細(xì)胞的放射耐受性，與先前的研究結(jié)論吻合。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)miRNA-155 后的SW620 細(xì)胞經(jīng)過放射線照射，其增殖、遷移和侵襲能力明顯降低；同時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，miRNA-155調(diào)控CRC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移可能與其在已證實(shí)的其他癌癥轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制類似。

為了進(jìn)一步探究miRNA-155 調(diào)控CRC 細(xì)胞侵襲和遷移的分子機(jī)制，通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miRNA-155的可能靶基因是HIF-1α。通過雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)證實(shí)HIF-1α 是miRNA-155 的靶基因。HIF-1α是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，其與炎癥、血管生成、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，可作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)不同種類腫瘤的轉(zhuǎn)移[17]。本研究表明，下調(diào)miRNA-155 降低了HIF-1α 蛋白的表達(dá)。研究已證，HIF-1α 被激活后通過活化PI3K/AKT 通路，抑制HIF-1α 羥基化后的降解，積聚的HIF-1α 啟動(dòng)VEGF 的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤新血管生成[18]。VEGF 是目前發(fā)現(xiàn)的重要的血管生成的調(diào)節(jié)因子，它的表達(dá)與腫瘤侵襲能力呈明顯正相關(guān)[19]。VEGF是HIF-1α的下游靶基因，HIF-1α的上調(diào)誘導(dǎo)VEGF基因表達(dá)和腫瘤血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miRNA-155能顯著降低VEGF 的表達(dá)水平[20]。以上結(jié)果提示，下調(diào)miRNA-155 可能是通過抑制HIF-1α/VEGF 信號通路降低SW620細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的能力。

綜上所述，下調(diào)miRNA-155能增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620的放射敏感性，抑制其增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能是抑制HIF-1α/VEGF 信號通路的激活。