萬(wàn) 兵，王 鶴

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，南寧 530021）

子宮頸癌（cervical cancer，CC）仍是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，在全球女性腫瘤的發(fā)病率和死亡率均居第四位[1]。宮頸癌中約99.7%以上存在人乳頭狀瘤病毒DNA，高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）的持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)病變（squamous intraepithelial lesion，SIL）及宮頸癌發(fā)生的主要致病因子。但并不是所有的宮頸HPV感染者都會(huì)朝著宮頸癌變的方向進(jìn)展[2]。除高危型HPV持續(xù)性感染外，宮頸微環(huán)境中的微生物群落的變化在對(duì)宮頸癌前病變（CIN）進(jìn)展及宮頸癌的發(fā)生中也起著十分重要的作用。在宮頸上皮細(xì)胞癌變過(guò)程中，可能存在其他致癌因素或協(xié)同HPV作用的因素，增加宮頸上皮細(xì)胞感染HPV 的易感性，導(dǎo)致HPV持續(xù)存在最終發(fā)生癌變，但這種致癌作用的潛在機(jī)制大部分仍然不清楚[3]。這些致癌因素包括遺傳因素、環(huán)境因素、細(xì)胞防御、免疫功能，以及特定于機(jī)體的基因和細(xì)胞因子[4]。

陰道是一個(gè)相對(duì)密閉、缺氧和定植著多種菌群的微生態(tài)環(huán)境，而宮頸陰道部直接暴露在陰道微生態(tài)環(huán)境中。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌是陰道中最主要的優(yōu)勢(shì)菌，可占90%左右[5]，與其他微生物共同構(gòu)筑起人體黏膜微生物屏障，其在拮抗多種病原菌、維持陰道微生態(tài)平衡和抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮重要的作用。鑒于乳酸桿菌作為定植于人體黏膜上的益生菌，卷曲乳酸桿菌又是其中檢出率最常見(jiàn)菌種之一。因此，本研究采用卷曲乳酸桿菌與宮頸鱗癌細(xì)胞（SiHa細(xì)胞）共培養(yǎng)，探討其抗腫瘤作用，以期為預(yù)防和治療宮頸癌提供新的策略和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與細(xì)菌 宮頸鱗癌細(xì)胞株SiHa 由上海交通大學(xué)第九人民醫(yī)院贈(zèng)送，經(jīng)STR鑒定與SiHa細(xì)胞完全匹配（EV 值為1.0），在含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和100 g/mL 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）中培養(yǎng)。卷曲乳酸桿菌（CGMCC：1.2743）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，在MRS 固體/液體培養(yǎng)基（北京索萊寶公司）分離和增菌培養(yǎng)，置于厭氧培養(yǎng)箱中。

1.2 共培養(yǎng)體系的建立 以5×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度將SiHa 細(xì)胞接種于6 孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)液，PBS 清洗2 次，再加入無(wú)青―鏈霉素含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液。卷曲乳酸桿菌在MRS液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)48 h后，用無(wú)抗生素含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液重懸，按細(xì)菌∶細(xì)胞=200∶1（即感染復(fù)數(shù)=200）加入每孔細(xì)胞中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h，分別在6 h、12 h、18 h、24 h 顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。以培養(yǎng)24 h 后未加卷曲乳酸桿菌的SiHa 細(xì)胞及細(xì)胞上清液作為對(duì)照組，記為0 h。

1.3 CCK-8法檢測(cè)共培養(yǎng)前、后的細(xì)胞活力 SiHa細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后更換為無(wú)青－鏈霉素的培養(yǎng)基，按感染復(fù)數(shù)=200加入卷曲乳酸桿菌，混勻，在含5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。檢測(cè)前棄去原培養(yǎng)液，然后向每孔加入100 μL無(wú)青－鏈霉素含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基及10 μL CCK-8試劑，避光培養(yǎng)2 h。正常組的空白孔為不含卷曲乳酸桿菌的新鮮培養(yǎng)液，共培養(yǎng)組的空白孔為含有等量卷曲乳酸桿菌的無(wú)抗生素新鮮培養(yǎng)液。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值，并減去同組的空白孔OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SiHa 細(xì)胞凋亡 收集正常組（未加卷曲乳酸桿菌）、陽(yáng)性對(duì)照組（加入30 μg/mL順鉑并培養(yǎng)48 h）及與卷曲乳酸桿菌共培養(yǎng)6 h、12 h、18 h 及24 h 的細(xì)胞上清液。用不含EDTA 的胰酶消化SiHa 細(xì)胞，與同孔細(xì)胞上清液混合后離心，棄去上清，加入100 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，分別加入5 μL PI和5 μL FITC染料，冰上避光反應(yīng)15 min 后再分別加入200 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，200 目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾后，用CytoFLEX 流式儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5 細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素（IL）-2含量檢測(cè)

收集正常組和與卷曲乳酸桿菌共培養(yǎng)6 h、12 h、18 h 和24 h 的細(xì)胞上清液，2 000 r/min 離心15 min 后收集上清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-2含量。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒（武漢Elabscience 公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）基因表達(dá)量 收集細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：95 °C 預(yù)變性30 s；95 °C 變性5 s，60°C 退火、延伸34 s，共循環(huán)40 次。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算PCNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：PCNA上游：5’-TCCATCCTCAAGAAGGTGTT-3’，下游：5’-GGTAGGTGTCGAAGCCC-3’；GAPDH 上 游：5’-CCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3’，下游：5’-CACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卷曲乳酸桿菌對(duì)SiHa 細(xì)胞形態(tài)的影響 正常組的SiHa 細(xì)胞體積較大，形態(tài)飽滿，呈梭形或多邊形，細(xì)胞核大，并可見(jiàn)較多處于分裂的細(xì)胞；加入卷曲乳酸桿菌共培養(yǎng)后，大量的卷曲乳酸桿菌黏附在SiHa細(xì)胞膜外，細(xì)胞體積逐漸縮小，形態(tài)變圓，細(xì)胞間隙逐漸增大，漂浮和死亡的細(xì)胞明顯增多，貼壁細(xì)胞明顯減少，見(jiàn)圖1。

圖1 卷曲乳酸桿菌對(duì)SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響（200×）

2.2 卷曲乳酸桿菌對(duì)SiHa 細(xì)胞增殖的影響 與正常組比較，共培養(yǎng)組在12 h后SiHa細(xì)胞增殖被顯著抑制（P＜0.001），見(jiàn)圖2。

圖2 卷曲乳酸桿菌對(duì)SiHa細(xì)胞增殖的影響

2.3 卷曲乳酸桿菌對(duì)SiHa 細(xì)胞凋亡的影響 共培養(yǎng)6 h、12 h、18 h 和24 h 的細(xì)胞較正常組細(xì)胞凋亡率顯著增高（均P＜0.01），陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率顯著高于共培養(yǎng)組（P＜0.001），見(jiàn)圖3。

圖3 卷曲乳酸桿菌對(duì)SiHa細(xì)胞凋亡率的影響

2.4 卷曲乳酸桿菌作用SiHa細(xì)胞不同時(shí)間后上清液中IL-2 含量變化 與正常組比較，IL-2 分泌量在共培養(yǎng)6 h 和12 h 顯著升高（P＜0.001），在共培養(yǎng)18 h 降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），共培養(yǎng)24 h顯著下降（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 卷曲乳酸桿菌作用SiHa細(xì)胞不同時(shí)間后上清液中IL-2含量變化

2.5 PCNA 基因在共培養(yǎng)前后的表達(dá)變化 與卷曲乳酸桿菌共培養(yǎng)6 h、12 h、18 h、24 h的SiHa細(xì)胞PCNA mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.650±0.147、0.430±0.226、0.212±0.241、0.242±0.081，與正常組（1.027±0.272）比較，在共培養(yǎng)12 h 開(kāi)始顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

乳酸桿菌的抗腫瘤作用的機(jī)制是多方面的，既可以通過(guò)激活宿主的免疫系統(tǒng)，也可以通過(guò)產(chǎn)生胞外多糖、細(xì)菌素等發(fā)揮抗癌作用。Shiomi 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳中的乳酸桿菌，其產(chǎn)生的胞外多糖在活的生物體內(nèi)同樣具有抗腫瘤活性。不同屬、種、株的乳酸菌都能分泌出不同的細(xì)菌素，具有很好的抗腫瘤效果。乳酸桿菌激活宿主免疫系統(tǒng)的途徑包括誘導(dǎo)IL-12、IL-2、IL-4、IFN-γ 等抗腫瘤因子的表達(dá)[7]，增強(qiáng)多種免疫細(xì)胞的免疫效力[8]，增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)宮頸腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷能力[9]，激活巨噬細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞。

本研究發(fā)現(xiàn)，SiHa細(xì)胞加入卷曲乳酸桿菌共培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)空亮、體積變小、形態(tài)變圓的細(xì)胞逐漸增多，漂浮的細(xì)胞明顯增多。同時(shí)，CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)12 h后SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始受到顯著抑制，細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0.05），說(shuō)明卷曲乳酸桿菌對(duì)SiHa 細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。Si-Ha細(xì)胞與卷曲乳酸桿菌共培養(yǎng)6 h和12 h后IL-2水平均顯著升高（P＜0.05），但隨著共培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，SiHa 細(xì)胞分泌的IL-2 水平出現(xiàn)了下降，在共培養(yǎng)24 h時(shí)IL-2水平顯著下降（P＜0.05），此時(shí)IL-2的表達(dá)下降可能與細(xì)胞凋亡和死亡顯著增高、活細(xì)胞數(shù)量大大減少有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，宮頸癌細(xì)胞中有IL-2的表達(dá)，加入低劑量的IL-2可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，而高劑量的IL-2 則表現(xiàn)出抑制作用[10]。宮頸癌細(xì)胞分泌的IL-2 可能在免疫逃逸和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方面起著重要作用。本研究結(jié)果提示，卷曲乳酸桿菌可刺激SiHa細(xì)胞分泌大量的IL-2，大量分泌出的IL-2 可能是抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要因素，可能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中Th1 型向Th2 型細(xì)胞因子漂移的現(xiàn)象，后續(xù)將進(jìn)一步研究卷曲乳酸桿菌作用細(xì)胞分泌IL-2的機(jī)制。

本課題組前期通過(guò)生物信息學(xué)分析初步篩選發(fā)現(xiàn)PCNA 是SIL 發(fā)生的差異基因。PCNA 作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志蛋白，參與DNA 合成、復(fù)制及損傷修復(fù)過(guò)程，其表達(dá)與腫瘤的惡性程度關(guān)系密切，PCNA表達(dá)越高，細(xì)胞增殖分裂的越快[11]。本研究中，宮頸癌SiHa細(xì)胞中PCNA表達(dá)在加入卷曲乳酸桿菌12 h后顯著下降（P＜0.05），PCNA基因降低趨勢(shì)與細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的情況一致。表明卷曲乳酸桿菌能通過(guò)下調(diào)宮頸癌SiHa 細(xì)胞的PCNA 表達(dá)而抑制宮頸癌SiHa 細(xì)胞的增殖。提示卷曲乳酸桿菌在抑制宮頸癌的增殖具有潛在應(yīng)用價(jià)值。本研究中PCNA的差異表達(dá)驗(yàn)證了本課題組此前的發(fā)現(xiàn)，可作為SIL預(yù)警分子靶標(biāo)。

鑒于益生菌對(duì)人體安全無(wú)毒，卷曲乳酸桿菌的抗癌研究近年來(lái)成為熱點(diǎn)。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可以靶向定植于實(shí)體腫瘤中，而在正常的組織中并未發(fā)現(xiàn)其的存在[12]。乳酸桿菌作為兼性厭氧菌，對(duì)實(shí)體腫瘤有著良好的靶向，可選擇性聚集于腫瘤的低氧區(qū)域，這為乳酸桿菌在腫瘤基因治療上提供了臨床應(yīng)用的新方向。Aires等[13]發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可較完整地表達(dá)HPV16型的病毒顆粒，并引起小鼠產(chǎn)生HPV16型病毒的抗體，可為乳酸桿菌作為黏膜疫苗用于防治宮頸病變提供重要的理論依據(jù)。隨著乳酸桿菌的深入研究和應(yīng)用，可為治療HPV感染及宮頸病變開(kāi)辟新的途徑，為防治SIL 和宮頸癌提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。