張耀杰，莫霄云，楊 朔，黃 琛，何貴新

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧 530011；廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023）

冠狀動(dòng)脈微循環(huán)是指由微動(dòng)脈、毛細(xì)血管以及微小靜脈組成的微循環(huán)系統(tǒng)，它的收縮與擴(kuò)張可顯著影響心肌血流量以及血管阻力[1]。經(jīng)冠脈造影顯示無冠脈狹窄，但癥狀反復(fù)、無明顯減輕的患者考慮為冠脈微循環(huán)疾?。╟oronary microcirculation disease，CMD）[2]。心臟磁共振是目前認(rèn)為有效檢查冠脈微循環(huán)疾病的手段之一[3-4]。CMD 根據(jù)臨床基礎(chǔ)可分為無心肌疾病和阻塞性冠狀動(dòng)脈的CMD、心肌疾病的CMD 等多種類型[5]，可因結(jié)構(gòu)性改變、內(nèi)皮依賴血管舒張改變、非內(nèi)皮依賴血管舒張改變等多種途徑導(dǎo)致CMD[6-8]。CMD 類型多樣、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有效防治該疾病仍是國內(nèi)、外研究的熱門話題。目前西醫(yī)治療具有時(shí)效性，易反復(fù)發(fā)作。近年來關(guān)于中醫(yī)藥的研究報(bào)道越來越多，中醫(yī)采用辨證論治，不良反應(yīng)少，治療CMD 有良好的臨床療效[9-10]。扶脈益心湯作為一中藥復(fù)方，包括扶芳藤、三七、薏苡仁，具有抗炎、抗心肌缺血、抗氧化等作用，相對比以往已驗(yàn)證的“丹參、川芎”等單一活血化瘀藥物，作用廣泛、副作用更小。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測潛在作用靶點(diǎn)及通路，用分子對接技術(shù)驗(yàn)證結(jié)合力，結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討扶脈益心湯治療CMD 的作用機(jī)制，為扶脈益心湯的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 扶脈益心湯活性成分及藥物靶點(diǎn)的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php，2021-4-1）數(shù)據(jù)庫以化合物口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，對三七、薏苡仁的有效成分進(jìn)行篩選，在Bataman（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/，2021-4-1）數(shù)據(jù)庫中設(shè)定score＞20，對扶芳藤的有效成分進(jìn)行篩選，并結(jié)合文獻(xiàn)。導(dǎo)入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/，2021-4-1）數(shù)據(jù)庫，以“人類”為研究物種、取得分＞0 的候選靶標(biāo)作為藥物靶點(diǎn)。

1.2 CMD靶點(diǎn)的獲取

使 用GeneCards（https://www.genecards.org/，2021-4-2）、OMIM(https://omim.org/，2021-4-2）、Disgenet（https://www.disgenet.org/，2021-4-2）等數(shù)據(jù)庫以“Coronary Microvascular Dysfunction”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得疾病作用靶點(diǎn)。

1.3 扶脈益心湯-CMD共同靶點(diǎn)的獲取

在Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺上分別錄入中藥復(fù)方與CMD的靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，得到藥物與疾病的共同靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建“扶脈益心湯－活性成分－作用靶點(diǎn)－CMD”網(wǎng)絡(luò)

將上述得到的藥物活性化合物和共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件，構(gòu)建“藥物－成分－靶點(diǎn)－疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將藥物－疾病共同靶點(diǎn)輸入到STRING((https://string-db.org/，2021-4-3)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，minimum required interaction score＞0.4，所得信息輸入Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，將PPI 網(wǎng)絡(luò)信息應(yīng)用Cytohubba插件篩選核心靶點(diǎn)。

1.6 GO和KEGG分析

將藥物—疾病共同靶點(diǎn)輸入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/,2021-4-5)數(shù)據(jù)庫得到GO、KEGG 所有詞條相關(guān)信息，KEGG 分析利用微生信在線工具根據(jù)詞條中富集基因數(shù)、P＜0.05 進(jìn)行繪圖，結(jié)果以氣泡圖形式輸出。

1.7 分子對接

藥物活性成分、共同靶點(diǎn)根據(jù)中心度（Degree）值取前5 位為核心成分及核心靶點(diǎn)，應(yīng)用iGEMDOCK軟件進(jìn)行分子對接，軟件采用“standard docking”對接，其余對接參數(shù)均為默認(rèn)。

1.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.8.1 構(gòu)建動(dòng)物模型 6～8 周齡無特定病原體動(dòng)物（SPF）雄性大鼠共25 只，體重(180±20)g，來源于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0006。取5只作為空白組，剩余的20只構(gòu)建成CMD 模型，大鼠腹腔注射巴比妥進(jìn)行全身麻醉（40 mg/kg），經(jīng)口管輔助通氣，打開胸腔暴露心臟及主動(dòng)脈根部，采用一次性1 mL BD胰島素針經(jīng)左心室注入月桂酸鈉(2 mg/kg 體質(zhì)量),同時(shí)夾閉主動(dòng)脈升部和主動(dòng)脈弓連接處10 s以保證注入的月桂酸鈉可以順利進(jìn)入冠狀動(dòng)脈，空白組注射生理鹽水(2 mg/kg 體重)，關(guān)閉胸腔后回籠復(fù)蘇，加熱墊保持體溫，手術(shù)過程注意無菌操作，術(shù)后常規(guī)給予青霉素80萬單位腹腔注射預(yù)防感染，連續(xù)注射3 d，通過病理切片觀察血管內(nèi)微血栓形成判定造模成功。模型構(gòu)建成功后隨機(jī)分為模型組（CMD組）、尼可地爾組、扶脈益心湯低劑量組、扶脈益心湯高劑量組，每組5只。扶脈益心湯的中藥組分（薏苡仁30 g、三七9 g、扶芳藤30 g）由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供，用蒸餾水煎煮濃縮配置成1 g生藥/mL的藥液，冰箱保存。尼可地爾片5 mg/片（國藥準(zhǔn)字H14023308，公司：山西同達(dá)藥業(yè)有限公司），使用時(shí)研磨成粉狀，并用蒸餾水至所需濃度的混懸液。扶脈益心湯低、高劑量組(劑量分別為2 g·kg-1·d-1、8 g·kg-1·d-1)灌胃，尼可地爾組按2.4 mg·kg-1·d-1灌胃，空白組、模型組每日等劑量生理鹽水灌胃。喂養(yǎng)4周。

1.8.2 實(shí)時(shí)熒光定量法 4 周后取各組大鼠60 mg心肌組織均勻研磨加入1 mL Trizol 提取總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：cDNA 模板1.0 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，SYBR Green Master 5μL，加ddH2O 至10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、35 s，共40 個(gè)循環(huán)。引物序列IL-6：上游5-TTCTTGGGACTGATGG-3’，下游5-TACTGGTCTGTTGTGGGTGGT-3’；IL-8：上游5-AGCCAACTCTCACTGAAGCC’-3’，下游5-AACTGTGAACAACAGGCCCA-3’；VEGFA：上游5-AATCAGTTCGAGGAAAGGGAAAGG-3’，下游5-AGGCTCACAGTGAACGCTCCAG-3’；MAPK3：上游5-CCAAACAAGCGCATCACAGT-3’，下游5-CCACTGGTTCATCTGTCGGA-3’。以Ct 值表示循環(huán)miRNA 表達(dá)水平，采用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-6、IL-8、VEGFA、MAPK3 等基因相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25～P75）］表示，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扶脈益心湯活性成分及藥物靶點(diǎn)篩選

結(jié)合TCMSP、Batman 數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)補(bǔ)充共得到有效活性成分25 個(gè)，見表1。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選出327個(gè)藥物靶點(diǎn)。

表1 中藥復(fù)方活性成分

2.2 CMD靶點(diǎn)篩選

在GeneCards、OMIM、Disgenet 數(shù)據(jù)庫檢索后，刪除去重共獲得疾病靶點(diǎn)1 604個(gè)。

2.3 扶脈益心湯-CMD共同靶點(diǎn)篩選

在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺上輸入327個(gè)藥物靶點(diǎn)、1 604 個(gè)疾病靶點(diǎn)，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)156個(gè)。

2.4 構(gòu)建“扶脈益心湯－活性成分－作用靶點(diǎn)－CMD”網(wǎng)絡(luò)

將中藥復(fù)方中25 個(gè)有效活性成分與156 個(gè)藥物－疾病共同靶點(diǎn)輸入Cytoscape3.7.1軟件中，繪制出“藥物－成分－靶點(diǎn)－疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1）。圖中紫色代表藥物，藍(lán)色代表中藥復(fù)方中的25種活性成分，綠色代表156個(gè)共同靶點(diǎn)，紅色代表疾病。

圖1 中藥復(fù)方－成分－靶點(diǎn)－疾病作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將156個(gè)共同靶點(diǎn)通過STRING數(shù)據(jù)庫所得信息輸入Cytoscape3.7.1 軟件得到相互作用的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，然后應(yīng)用Cytohubba 插件根據(jù)degree 值排名得到15個(gè)核心靶點(diǎn)（圖2）。156個(gè)共同靶點(diǎn)顏色由黃色到紅色，顏色越紅degree值越高，越趨向于核心靶點(diǎn)，如圖2a。經(jīng)Cytohubba軟件得到score 分值最高15個(gè)核心(hub)靶點(diǎn)如圖2b。

圖2 共同靶點(diǎn)及核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO及KEGG分析

2.6.1 GO分析將156個(gè)共同靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫得到GO 中生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)及分子功能(MF)3部分的相關(guān)詞條信息，共富集至2 236條生物學(xué)過程、83條細(xì)胞組分表達(dá)過程、146個(gè)與分子功能過程中。3 個(gè)部分中BP 主要涉及signal transduction(信號傳導(dǎo))、positive regulation of cell proliferation(細(xì)胞增殖的正向調(diào)控)等；CC主要涉及plasma membrane(質(zhì)膜)、nucleus(核心)等；MF 主要涉及protein binding(蛋白結(jié)合)、zincion binding(鋅離子結(jié)合)等。

2.6.2 KEGG通路富集分析 將156個(gè)共同靶點(diǎn)通過DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 分析得到141 條富集通路，基于P＜0.05 的條件下，取富集基因數(shù)（count值）最高的前20 位用微生信在線軟件繪制氣泡圖（見圖3）。圖中pvalue 代表富集的顯著性，該值從小到大，對應(yīng)紅色到綠色，顏色越紅則顯著性越高。KEGG 分析結(jié)果顯示以上靶點(diǎn)主要富集到PI3K-Akt 信號通路、FoxO 信號通路、VEGF 信號通路、HIF-1 信號通路等。結(jié)合CMD，關(guān)鍵通路主要涉及PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路。

圖3 KEGG富集分析

2.7 分子對接結(jié)果

25 個(gè)藥物活性成分、156 個(gè)共同靶點(diǎn)根據(jù)Degree值取前5位進(jìn)行分子對接，5個(gè)核心成分分別是Quercetin（槲皮素）、Stigmasterol（豆甾醇）、Mandenol（十八碳）、DFV（二羥基黃烷酮）、2-Monoolein（2-單油酸甘油酯）,5 個(gè)核心靶點(diǎn)分別是AKT1（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1）、MAPK3（絲裂原活化蛋白激酶3）、EGFR(表皮生長因子受體)、SRC(原癌基因酪氨酸蛋白激酶)、VEGFA(血管內(nèi)皮生長因子A)。將核心成分及核心靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)式圖（見圖4）導(dǎo)入iGEMDOCK軟件得到AKT1、MAPK3、EGFR、SRC、VEGFA 與原有配體分子對接能量值分別是-130.18、-68.30、-78.27、-101.82、-83.71，5 個(gè)核心成分與這些核心靶點(diǎn)的對接能量負(fù)值接近或者高于核心靶點(diǎn)與原有配體分子的對接能量值，顯示成分和靶點(diǎn)結(jié)合力較好。

圖4 核心成分與核心靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)式圖

2.8 熒光定量結(jié)果

熒光定量結(jié)果顯示：模型組IL-6、IL-8、MAPK3等mRNA 表達(dá)水平高于空白組（P＜0.05），VEFGAmRNA 表達(dá)水平低于空白組。與模型組相比，扶脈益心湯高劑量組和尼可地爾組IL-6、IL-8、MAPK3 等mRNA 表達(dá)水平降低，VEGFAmRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05 或P＜0.01）；扶脈益心湯低劑量組IL-8、MAPK3 等mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05），但在IL-6、VEGFA等mRNA表達(dá)上與模型組變化不顯著（P＞0.05），見圖5。

圖5 IL-6、IL-8、VEGFA、MAPK3表達(dá)水平柱狀圖

3 討論

2017 年我國專家學(xué)者發(fā)表共識，提出CMD 是冠脈微循環(huán)結(jié)構(gòu)和(或)功能改變所致的勞力性心絞痛或心肌缺血客觀證據(jù)的臨床綜合征[11]。CMD 影響著患者生活質(zhì)量，加強(qiáng)該疾病的治療具有重要的臨床意義[12-13]。近年來西醫(yī)治療雖有效，但有時(shí)效性，容易反復(fù)。中醫(yī)藥治療CMD，有良好的臨床療效，并且毒副反應(yīng)少，適宜于長期用藥。

扶脈益心湯作為中藥復(fù)方，包含了薏苡仁、三七、扶芳藤等三味中藥。薏苡仁可以降低人體血漿總膽固醇、降低血脂水平[14]，三七具有抗血栓、抗炎等作用[15]，扶芳藤具有抗血栓、調(diào)節(jié)血脂等作用[16]。

基于扶脈益心湯活性成分分析，通過分析得出25個(gè)有效活性成分，包括豆甾醇、薏苡仁酯、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、沒食子酸、木栓酮等，其中豆甾醇、薏苡仁酯有調(diào)節(jié)血脂、降壓等作用[17]。人參皂苷Rg1、三七皂苷R1 等具有抑制炎癥因子、改善心肌氧代謝、抑制氧化應(yīng)激等方面作用[18-19]。沒食子酸、木栓酮具有降低心肌耗氧、清除氧化自由基等作用[20]。

基于PPI 分析及KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)藥物的活性成分與疾病的靶點(diǎn)密切關(guān)聯(lián)。基于PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果得到AKT1、VEGFA、MAPK3、SRC、EGFR、STAT3、PTGS2、MMP9、MAPK8 等15 個(gè)核心靶點(diǎn)，這些核心靶點(diǎn)中心度值最高排名得到AKT1、MAPK3、EGFR、SRC、VEGFA 等關(guān)鍵核心靶點(diǎn)。AKT1 調(diào)節(jié)代謝、增殖、血管生成在內(nèi)的許多過程；MAPK3 參與介導(dǎo)細(xì)胞生長、分化等生物過程；EGFR可以將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)化為適當(dāng)?shù)募?xì)胞反應(yīng)；SRC 參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)化等生物過程；VEGFA誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制凋亡和誘導(dǎo)血管通透性。這些關(guān)鍵核心基因功能與GO 分析BP 相對應(yīng)。KEGG 分析結(jié)果結(jié)合CMD，關(guān)鍵涉及PI3K-Akt 信號通路、VEGF信號通路。PI3K-Akt信號通路，該通路的激活對細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等方面有著重要作用，促進(jìn)PI3K-Akt信號蛋白的表達(dá)可以減輕心肌缺血，對心肌缺血起著保護(hù)效應(yīng)[21]。VEGF 信號通路，該通絡(luò)的激活可誘發(fā)血管內(nèi)皮生成內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增值、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)毛細(xì)血管網(wǎng)生成[22]。炎癥在CMD 中起著重要作用，PI3K-Akt 信號通路、VEGF信號通路與炎癥密切相關(guān)，激活這些通路可促進(jìn)細(xì)胞釋放IL-6、IL-8 等炎癥因子，促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)[23-25]。關(guān)鍵核心靶點(diǎn)VEGFA、MAPK3均可富集到PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證通過熒光定量法檢測IL-6、IL-8、VEGFA、MAPK3等mRNA表達(dá)水平，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出扶脈益心湯高劑量組對于模型組（CMD 組）可顯著降低IL-6、IL-8等炎癥因子水平，下調(diào)MAPK3靶點(diǎn)基因，上調(diào)VEGFA 靶點(diǎn)基因（P＜0.05），說明扶脈益心湯通過作用于抗炎、抗氧化、改善細(xì)胞內(nèi)皮功能等相關(guān)的靶點(diǎn)及通路，從而達(dá)到治療CMD 的目的。分子對接結(jié)果顯示成分與靶點(diǎn)間具有較強(qiáng)的結(jié)合力，進(jìn)一步支持了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，扶脈益心湯可以通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路途徑作用于CMD，但本研究亦存在一定局限性，缺乏大樣本、多中心的臨床研究支持，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。