謝葉紅，蔣順寧，胡雪竹，李學(xué)冬

（四川省成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，成都 611730）

隨著工業(yè)化程度的迅速發(fā)展，全球支氣管哮喘患病率逐年增高[1]。目前針對(duì)哮喘患者，臨床常選用激素類(lèi)藥物，但該類(lèi)藥物的抗炎作用對(duì)重度或激素抵抗型哮喘類(lèi)患者治療效果并不理想[2]。慢性炎癥反應(yīng)引起機(jī)體氣道高反應(yīng)性，反復(fù)發(fā)作導(dǎo)致病情嚴(yán)重、治療困難，而激素抵抗患者可能是激素與胞漿內(nèi)激素受體特異性結(jié)合效率降低，受體表達(dá)量不足，從而難以發(fā)揮藥物抗炎作用[3]。肺力咳合劑由黃芩、前胡、百部等中藥配合制成，具有清熱解毒、止咳祛痰功效，常用于治療小兒支氣管炎、肺炎等[4]。目前關(guān)于肺力咳合劑對(duì)哮喘進(jìn)展中氣道炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制研究尚少。有研究證實(shí)，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在調(diào)控哮喘炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用[5]。鑒于此，本研究觀察肺力咳合劑對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥的抑制作用，并探討其對(duì)炎癥反應(yīng)信號(hào)通路NF-κB/MAPK的影響，以期為臨床用藥提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，50只，4周齡，體重（200±20）g，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0001，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（皖）2017-005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批號(hào)：IACUC-20170701，實(shí)驗(yàn)符合減少、替代和優(yōu)化（3R）原則。

1.2 藥物和主要儀器、試劑

肺力咳合劑（貴州健興藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025136，規(guī)格：100 mL，批號(hào)：20170628），卵清蛋白（Sigma-A5503，批號(hào)：326A056），氫氧化鋁粉（Thermo 公司，批號(hào)：OA181048），白介素（IL）-6（批號(hào)：2017110201A）、IL-1β（批號(hào)：2017110122A）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo 公司，批號(hào)：23225、34617），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司，批號(hào)：6210A），DAB 顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：DA1010），兔抗鼠NF-κB p65、p-p65單抗、p38 MAPK、p-p38 MAPK 多抗（Santa Cruz 公司，批號(hào)：1783-1、1758-1、1752-1、1830-1）；JZ-8B 型大小鼠霧化給藥器（北京九州晟欣科技有限公司），SM2010R切片機(jī)、EG1150分體式包埋機(jī)（徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司），CX23 光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯公司），800TS酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），TY-80電泳儀（南京普陽(yáng)科學(xué)儀器研究所），iQ5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）儀、CheniDoc XRS 化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（Bio-rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組 取50只大鼠，其中40 只腹腔注射卵清蛋白致敏和霧化吸入法建立哮喘大鼠模型[6]：實(shí)驗(yàn)第1、第8 天分別腹腔注射2 mL 致敏混懸液（卵清蛋白1 mg+氫氧化鋁粉100 mg），第15天起，給予50 mL 1%卵清蛋白（溶于生理鹽水）進(jìn)行霧化40 min，2 d/次，共6 次，大鼠出現(xiàn)呼吸加快、精神萎靡、黏膜發(fā)紺等情況時(shí)提示建模成功，將其隨機(jī)分為4組：哮喘組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2 組、實(shí)驗(yàn)3 組。剩余10 只均以生理鹽水代替致敏混懸液和霧化液，其他操作相同，設(shè)為對(duì)照組。末次霧化后6 h，實(shí)驗(yàn)1 組、實(shí)驗(yàn)2 組、實(shí)驗(yàn)3 組大鼠分別給予1 mL/kg、2 mL/kg、4 mL/kg 肺力咳合劑灌胃，哮喘組和對(duì)照組均給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d。

1.2.2 肺泡灌洗液（BALF）中IL-6、IL-1β、TNF-α水平檢測(cè) 收集BALF 離心上清液，應(yīng)用ELISA 檢測(cè)BALF 中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量，所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處吸光度值，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.3 肺組織病理觀察 取大鼠右肺組織，立即放入4%中性甲醛中浸泡24 h，常規(guī)石蠟包埋，制作4 μm連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、酒精梯度水化、熱修復(fù)后，行蘇木精－伊紅（HE）染色，以中性樹(shù)膠封片后于光鏡下觀察。

1.2.4 qPCR 法檢測(cè)肺組織NF-κB p65、p38 MAPK mRNA 相對(duì)表達(dá)量 取新鮮右肺組織約75 mg，采用Trizol 法提取組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，10×buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTP 1 μL，Taq 8.5 μL，ddH2O 10 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)42 個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。NF-κB p65 上游引物：5’-ATCTGCTAGTCGATCGATCGTAG-3’，下游：5’-CATCGATCGTAGCATCGATCGTA-3’；p38 MAPK上游引物：5’-ATCAGATGCTAGCTAGCTAGCGC-3’，下游：5’-CTAGCTACGATCGATCGATCGTAT-3’；β-actin 上 游 引物：5’-AAGCTACGATCGATCGTACGTGG-3’，下游：5’-GGTCAGTCGTACGTAGCTACGTC-3’。

1.2.5 Western blotting 法檢測(cè)肺組織NF-κB p-p65和p-p38 MAPK 蛋白表達(dá) 取新鮮右肺組織約75 mg，勻漿儀研磨后轉(zhuǎn)至離心管，加入細(xì)胞核裂解液，12 000 r/min離心10 min后取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE 分離蛋白，60 min 后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；封閉2 h，加入一抗稀釋液（均為1∶800）置于4 ℃冰箱搖床孵育過(guò)夜，然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫下孵育1 h。ECL暗室發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描，ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值。計(jì)算NFκB p-p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK 蛋白比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組BALF中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較

5 組BALF 中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平從低至高排列如下：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)1組、哮喘組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 BALF中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較pg/mL，

表1 BALF中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較pg/mL，

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較，cP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)2組比較，dP＜0.05。

2.2 肺組織病理學(xué)觀察

HE 染色顯示：對(duì)照組無(wú)明顯異常，哮喘組肺泡輪廓不清晰、肺泡壁水腫、增厚明顯，多量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)組上述變化均較哮喘組減輕，其中實(shí)驗(yàn)2組減輕最為明顯，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠肺組織HE染色圖（×400）

2.3 5組肺組織中NF-κB p65、p38 MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

5組大鼠肺組織中NF-κB p65、p38 MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 5組肺組織NF-κB p65、p38 MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

表2 5組肺組織NF-κB p65、p38 MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 5 組肺組織NF-κB p-p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白比值比較

5組肺組織NF-κB p-p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK 蛋白比值從低至高排列如下：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)1組、哮喘組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖2、表3。

圖2 Western blotting蛋白電泳圖

表3 5組肺組織NF-κB p-p65和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)量比較

表3 5組肺組織NF-κB p-p65和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)量比較

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較，cP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)2組比較，dP＜0.05。

3 討論

肺力咳合劑方以黃芩、前胡、百部為君藥，歸肺經(jīng)，具有宣肺止咳、清熱利濕、降氣化痰功效；紅花龍膽、梧桐根為臣藥，歸肺、肝、膽、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、合血祛濕功效；白花蛇舌草、紅管藥為佐使藥，歸胃、大腸、小腸經(jīng)，可增強(qiáng)前胡清熱利濕作用，且可加強(qiáng)升降協(xié)助[7-9]。諸藥合用，共奏宣散肺邪、化痰平喘之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肺力咳合劑組方中的紅花龍膽具有較強(qiáng)的抗乙酰膽堿受體抗體作用，可緩解支氣管平滑肌痙攣，同時(shí)具有抑制炎癥滲出作用[10]。黃芩作為肺力咳合劑的主要成分之一，在抑制氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮中藥作用，Wang 等[11]通過(guò)應(yīng)用不同劑量黃芩苷對(duì)慢性阻塞性肺病大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有保護(hù)肺功能、調(diào)節(jié)肺部促炎和抗炎因子、抑制氣道阻塞和抗氧化的作用。

NF-κB/MAPK 信號(hào)通路異常激活通過(guò)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控關(guān)鍵靶分子轉(zhuǎn)錄進(jìn)程，從而控制目的基因表達(dá)[12-13]。NF-κB正常情況下并無(wú)活性，當(dāng)環(huán)境變化或者受到異常刺激后，上游通路接收相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后NF-κB磷酸化激活轉(zhuǎn)至核內(nèi)，通過(guò)調(diào)控下游促炎因子和炎癥抑制因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)，而哮喘患者氣道重構(gòu)及炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展均與NF-κB磷酸化相關(guān)[14]。本研究采用注射卵清蛋白致敏引發(fā)哮喘后，大鼠氣道損傷嚴(yán)重，可能與MAPK 信號(hào)通路激活，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)，與既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似[15]。肺力咳合劑中含有黃芩，吳佳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可通過(guò)抑制Toll-樣受體4（TLR4）/NF-κB 信號(hào)通路而抑制慢性阻塞性肺疾病患者炎癥反應(yīng)；在蔣寅等[17]的研究中，黃芪苷可通過(guò)抑制NF-κB/MAPK 信號(hào)通路而抑制炎癥損傷，推測(cè)肺力咳合劑可能通過(guò)直接或間接激活NF-κB/MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。此外，肺力咳合劑中紅花龍膽、梧桐根也具有顯著抑制炎癥反應(yīng)，可能通過(guò)抑制NF-κB、MAPK磷酸化而達(dá)到抑制炎癥細(xì)胞趨化及炎癥因子分泌的作用。

氣道平滑肌細(xì)胞大量增生甚至變形可導(dǎo)致正常氣道結(jié)構(gòu)改變，同時(shí)伴隨細(xì)胞外膠原沉積、基底膜增厚、腺體及周?chē)⊙芗懊?xì)血管增生等變化均是哮喘患者氣道重塑的病理基礎(chǔ)，而單純抗炎治療可能仍難以控制甚至抑制氣道重塑進(jìn)程[18]。本研究應(yīng)用不同劑量肺力咳合劑對(duì)對(duì)哮喘大鼠進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，哮喘組肺組織炎癥反應(yīng)明顯；3個(gè)實(shí)驗(yàn)組炎癥反應(yīng)均減輕，其中實(shí)驗(yàn)2組減輕最為明顯，提示肺力咳合劑可有效緩解哮喘大鼠氣道炎癥，以2 mL/kg劑量效果最佳。哮喘大鼠肺組織炎癥病變減輕證實(shí)，肺力咳合劑對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥有顯著抑制作用。各組肺組織NF-κB p-p65/NF-κB p65、pp38 MAPK/p38 MAPK 蛋白比值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示肺力咳合劑對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥的減輕作用與抑制NF-κB/MAPK 信號(hào)通路有關(guān)。由此可見(jiàn)，肺力咳合劑對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥的緩解作用機(jī)制可能與抑制NF-κB/MAPK 信號(hào)通路有關(guān)。

本研究也存在一定不足之處，關(guān)于肺力咳合劑是否通過(guò)其他信號(hào)通路抑制氣道炎癥反應(yīng)未進(jìn)行探討，在進(jìn)一步的研究中，需增加其他信號(hào)通路變化的研究，為肺力咳合劑用于抑制哮喘患者炎癥反應(yīng)提供更多理論支持。