王守峰，吳俊偉，蘇劉福，葉甲舟

（廣西壯族自治區(qū)腫瘤醫(yī)院，南寧 530021）

食管癌（sophageal cancer，EC）在全球所有類型的癌癥中的發(fā)病率為第7 位，患者的存活率低。在中國，食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占EC 患者的95%以上。由于對于ESCC 的早期檢測沒有敏感的方法，所以被診斷時，大部分EC患者已經處于疾病晚期，且這些患者在診斷時有超過一半發(fā)生了癌細胞轉移。因此，對于早期ESCC的預測和治療非常重要[1]。然而，目前暫無有效的治療方法，放、化療是唯一的治療選擇。腫瘤靶向藥物是近年來治療的主要趨勢，通過選擇性作用突變蛋白或基因，有針對性地抑制癌細胞，幾乎不影響正常細胞，具有“高效低毒”的特點。然而，靶向藥的應用前提需要明確患者具體突變類型，以判斷患者能否從中獲益。同時，由于缺少腫瘤中基因突變的具體信息，針對某類腫瘤藥物的靶向藥物開發(fā)也會陷入困擾[2]。高通量測序能夠同時檢測多個基因多位點突變，融合基因，基因拷貝數變化，基因缺失/擴增等功能，已逐漸被運用在指導晚期癌癥的用藥中[3]。研究表明，針對患者具體的靶點選擇合適的新輔助化療手段，已被證明可提高對卵巢癌[4]、HER2 陽性乳腺癌[5]等的治療效果。本研究將利用高通量測序分析ESCC樣本的熱點基因突變情況，分析主要突變位點、突變類型和頻率，為尋找ESCC 的生物標志物以及潛在藥物作用靶標提供基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2020年1～12月就診于廣西壯族自治區(qū)腫瘤醫(yī)院的65例ESCC患者的腫瘤組織，其中女24 例，男41 例，年齡30～75 歲，平均（55.26±8.6）歲，且排除其它腫瘤。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，研究對象簽署知情同意書。

1.2 DNA 的提取和文庫的準備 使用QIAamp DNA 的FFPE 組織試劑盒（德國Qiagen,Hilden）提取DNA。使用Qubitds DNA HS 檢測試劑盒和Qubit 3.0 測度計(Life Technologies,Eugene,Oregon,USA)定量DNA。按照Illumina 標準庫建設說明構建順序庫（Illumina，Inc，美國加利福尼亞州）。根據制造商提供的方法，文庫構建的最佳DNA 為20 ng（1.67 ng/μL），最小DNA為5 ng（0.41 ng/μL）。每個文庫都使用KAPA SYBR?FAST 通用qPCR 工具包進行量化。

1.3 樣本分析將樣本送至至本醫(yī)療科技公司進行溯系列分析（Illumina 高通量測序平臺），根據操作流程進行超深度測序（平均測序深度大于500×），共檢測638 個癌癥相關基因的全部外顯子，63 個基因的部分內含子，鑒定不同類型的基因變異，如單核苷酸變異、插入或缺失、拷貝數變異和重排。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0 與SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差()表示，多組間比較采用方差分析；計數資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ESCC患者不同年齡段人數統(tǒng)計 通過統(tǒng)計患者年齡、性別和發(fā)病率，本研究其中男患者分布：30～39歲，3例；40～49歲，5例；50～59歲，20例；60～69歲，11 例；70-75 歲，2 例。女患者：30～39 歲，1 例；40～49歲，3例；50～59歲，12例；60～69歲，7例；70～75歲，1 例。患者年齡主要集中于50～69 歲，男患者與女患者在此年齡段的比例分別為75.61%和79.17%。

2.2 ESCC高頻突變基因 根據檢測結果統(tǒng)計突變率（圖1），突變率排名前10 的基因分別為TP53（90.77%）、CCND1（53.85%）、FGF19（52.31%）、FGF3（50.77%）、FGF4（50.77%）、CDKN2A（32.31%）、KMT2D（21.54%）、NOTCH1（21.54%）、TP63(20%)、ZNF750（18.46%）、LRP1B（18.46%）。

圖1 ESCC中突變率前10的基因及各自的突變率

2.3 不同類型的突變在65例中的分布情況 從本研究的65 個患者基因突變類型（alternation type）分析中可以得出，92.31%（60/65）發(fā)生了拷貝數改變（copy number change）。而這60 個發(fā)生拷貝數改變（copy number change）的人中，絕大多數，即93.33%（59/60）發(fā)生了基因擴增（gene amplification），23.33%（14/60）發(fā)生了基因缺失（gene deletion），且以上同時發(fā)生了基因擴增和缺失的占23.33%（14/60）。

65例患者都發(fā)生了短變體(short variants)，且都伴隨著替換(substitution)。53.85%（35/65）發(fā)生在chr17（17 號染色體），其次為chr2，52.31%（34/65），chr1，chr9，chr12，chr8，chr3，chr4，chr19 和chr11 的突變率也呈現較為集中的分布。這65例中，83.08%(54/65)發(fā)生了截斷突變(truncation)，也以chr17上最多，占57.41%(31/54)，但是具體突變的點分布均勻，未見集中改變的堿基位點。除了這2類主要的突變類型，38.46%(25/65)發(fā)生了較長片段的插入與缺失（indel，insertion 和deletion 的簡稱）；30.77%(20/65)發(fā)生了重新排列（rearrangement），見圖2～圖4。

圖2 基因突變類型及在樣本中的突變分布

圖3 發(fā)生拷貝數變異的細分類型及分布

圖4 ESCC患者不同染色體基因突變分布

2.4 高頻突變基因的主要突變類型和位點 TP53的突變與多種癌癥有關。針對TP53 突變的患者進行分析發(fā)現，59 例發(fā)生了該突變的患者中，突變類型（alternation type）皆為短變體(short variants)，主要為截斷突變(truncation)（44.07%，26/59）和替換(substitution)（45.76%，27/59），皆位于chr17 染色體。進一步分析發(fā)現，這27個替換樣本中，40.74%（11/27）發(fā)生基因組DNA 變化。基因組DNA 中，堿基被替換成A 是主要變化，而Coding DNA 中的堿基替換成T是主要變化，見表1。

表1 TP53突變位點信息

針對CCND1 的突變進行分析發(fā)現，35 個CCND1突變的患者中，其主要是突變類型為拷貝數變化，97.14%（34/35）的該突變的患者發(fā)生基因擴增，無突變位點信息。針對FGF3 突變類型進行分析，發(fā)現96.76%（32/33）發(fā)生了拷貝數改變（基因擴增）。同樣分析FGF19，97.06%（33/34）發(fā)生了拷貝數改變（基因擴增），FGF4 突變中94.76%（32/33）發(fā)生了拷貝數改變（基因擴增）。分析CDK2A突變發(fā)現，其主要發(fā)生了拷貝數改變（基因擴增），無具體突變位點。

CDKN2A的突變位點分析結果顯示，該位點的突變位于chr9 上（表2），突變位點無聚集性。KMT2D 的突變位點分析結果顯示，其主要為G/C堿基被替換（表3）。NOTCH1突變信息顯示其主要突變?yōu)镚/C堿基被替換成A/T（表4）。ZNF750突變信息無集中突變類型和位點（表4），LRP1B 突變信息顯示主要突變?yōu)镚/C堿基被替換成A/T（表5）。

表2 CDKN2A突變位點

表3 KMT2D突變信息

表4 NOTCH1突變信息

表5 ZNF750突變信息

2.5 ESCC 靶點預測 將前10 個高突變基因進行STRING分析，結果顯示TP53，NOTCH1，CCND1之間存在關聯。其中NOTCH1和TP63為表皮細胞調控的關鍵蛋白（紅球），NOTCH1 和FGF4（藍球）是細胞凋亡過程中的關鍵蛋白。表明ESCC的發(fā)生與NOTCH1/TP63或NOTCH1/FGF4通路相關。見圖5。

圖5 STRING分析結果

表6 LRP1B突變信息

3 討論

EC在全世界的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，且與地理位置及飲食習慣有關，我國46%的EC 死亡可歸因于吸煙和酒精攝入，且男女患者的比例接近[6]。近年來，ESCC 的治療效果一直不盡人意，主要原因與診斷較晚，遠處轉移，治療耐藥，腫瘤異質性和復發(fā)有關。目前ESCC缺乏高效的靶向治療藥物[7]，派姆單抗和尼魯單抗（pembrolizumab and nivolumab）現在已被批準用于食管鱗癌，但需要更多的數據來了解這些藥物如何在非轉移性環(huán)境中使用。由于整體預后不佳，仍需要新的治療方法[8]?，F有的方法包括癌癥疫苗和免疫檢查點抑制劑[9]，以及以NRF2 等信號通路為靶標的藥物治療[10]，放射治療等[11]。但由于地域不同，基因的突變類型往往也存在差異，傳統(tǒng)的候選基因法建立在假說之上，需要進行功能驗證，且通量低，無法鑒定出未知的變異位點，因此需要更加全面、高通量的測序方法選擇靶點。

隨著第二代測序技術的發(fā)展，關于EC 基因層面的研究也隨之深入[12]。其中，Salem 等[13]揭示了225例中國河北地區(qū)患者的ESCC突變情況，發(fā)現該地區(qū)ESCC 患者中最常見的突變基因是TP53（96%）、CCND1（46%）、FGF4（44%）、FGF19（44%）、FGF3（44%）、CDKN2A（31%）、PIK3CA（26%）、NOTCH1（24%）、KMT2D（18%）、FAT1（16%）和LRP1B（16%），FGFR1 在ESCC 中擴增明顯更多。并揭示了中國ESCC 患者的潛在預后生物標志物。臨床靶基因分析表明，近一半的中國ESCC 患者可能會受益于基因特異性靶標藥物的治療[14]。而Song 等[15]的研究發(fā)現，廣東省潮汕地區(qū)ESCC 患者中TP53、RB1、CDKN2A、PIK3CA、NOTCH1 和NFE2L2 為突變率最高的基因。因此，分析不同地區(qū)ESCC 的基因突變差異，并進一步闡明ESCC 的分子機制，對于制定更好的預防和治療策略是非常有必要的。

分析以上研究不難發(fā)現，腫瘤蛋白p53（TP53）是ESCC 中最常見的突變基因。TP53 突變與高危疾病，對常規(guī)化療的耐藥性和預后不良有關[16]。p53在ESCC的診斷和治療中都是一個有價值的分子靶標。本研究發(fā)現，ESCC發(fā)生的突變類型中TP53突變率最高，表明其在ESCC 的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用。這與Gao 等[17]的研究結果一致，即EC 中，TP53 突變占主導，約為93%，其次為CCND1，占33%、CDKN2A 占20%。Kamata 等[18]用不同TP53突變的ESCC細胞株和兩種p53靶向藥物進行了細胞活力測定，發(fā)現兩種細胞株的生長抑制存在差異。提示腫瘤對化合物的響應可能取決于TP53 突變類型，但仍有必要進一步研究TP53與其他基因的相互作用，以確定其作為治療靶點的有效性。

NOTCH是指編碼哺乳動物細胞中跨膜受體家族的一組基因，參與胚胎發(fā)育和正常細胞的生長調節(jié)、凋亡和分化。NOTCH1是Notch家族的成員，與許多與腫瘤發(fā)生有關的信號通路緊密相連。在嚙齒動物和人類的正常食道中，NOTCH1 高度表達，在正常生理狀態(tài)下，NOTCH 通路調控食管鱗狀上皮的發(fā)育，特別是鱗狀分化，對于維持鱗狀上皮的完整性是必不可少的[19]。暴露于外在和內在因素，如胃食管反流、飲酒和炎癥，都會下調NOTCH 通路，從而抑制食管鱗狀上皮細胞的鱗狀分化。在ESCC中，NOTCH信號通路具有抑癌和致癌的雙重作用?？梢酝ㄟ^多種方法來實現NOTCH1抑制，其中最常見的方法是產生泛NOTCH抑制作用的分泌酶抑制劑DAPT(GSI-IX)，或者使用產生更特異的阻斷作用的NOTCH1短干擾RNA或NOTCH1單克隆抗體。NOTCH1的下調可以單獨使用，也可以與化學療法聯合使用，從而達到協(xié)同作用并降低耐藥發(fā)生[20]。最近，Alvarez-Trotta 等[21]發(fā)現了一種小分子抑制劑NADI-351，能夠選擇性地破壞EC 細胞中NOTCH1轉錄，在小鼠模型中表現出強大的抗腫瘤活性，且不會引起腸道毒性。這為今后的研究提供了一定的參考。

本研究通過蛋白之間相互作用預測發(fā)現，NOTCH 突變可能和TP53 存在一定聯系。研究表明，突變、缺失和擴增改變了TP53、NOTCH1、CDKN2A和CCND1等基因的正常功能，是促進食管黏膜上皮細胞向ESCC 轉化的關鍵變化，這與本研究非常接近。Zhang等[14]研究中，河北地區(qū)ESCC患者的TP53、CCND1、FGF4、FGF19、FGF3、CDKN2A、NOTCH1、KMT2D 和LRP1B（排前10 的突變）也是較高的突變。不同的是，他們的研究中PIK3CA 和FAT1的突變率較高，而本研究中ZNF750和TP63相對較高，而Song 等[15]的研究發(fā)現，廣東省潮汕地區(qū)ESCC患者中TP53、RB1、CDKN2A、PIK3CA、NOTCH1和NFE2L2（排名從高到低）為突變率最高的基因。表明不同區(qū)域ESCC 突變存在共性與差異。

對于NOTCH1 相關通路的預測發(fā)現，其在ESCC發(fā)生發(fā)展的過程中存在重要作用。正如Jia等[22]的研究發(fā)現，GASC1/NOTCH1 信號通路可能是治療ESCC 患者的潛在治療靶點。研究表明，NOTCH1 能夠通過促進上皮－間質轉化（EMT）和調節(jié)細胞周期來加速三陰性乳腺癌，抑制NOTCH1-ATR-CHK1 級聯與順鉑協(xié)同殺傷TNBC，為這種致命疾病提供了有效的臨床選擇[23]?；诖?，我們可以進一步研究其在ESCC的作用。

之前的研究已經提出了FGF19、FGF4、FGF3和CCND1在各種癌癥中的重要作用[13,24-25]。在染色體不穩(wěn)定的情況下發(fā)生的熔斷橋循環(huán)擴增了CCND1[26]。CCND1 通常與其鄰近的致癌基因CTTN 共同擴增，其產物促進ESCC 細胞的遷移[27]。此外，ESCC中的FGFR1、MYC、EGFR、KRAS、MDM2、TP63 和PRKC、SOX2 和PIK3CA、NKX2-1也都已被證實是ESCC 的驅動因素[1]。與之前的研究類似，本研究也觀察到CCND1、FGF19、FGF3 和FGF4 的頻繁擴增，這支持了ESCC 患者染色體11q13 不穩(wěn)定的發(fā)生。EC 的發(fā)病機制涉及一個由多個因素和基因突變積累組成的級聯過程。在其它研究中，與ESCC 相關高頻突變基因的還包括PTEN、TOP2A、PIK3CA、XRCC1等[28]。

綜上，本研究通過高通量測序展示了廣西地區(qū)ESCC 高頻突變基因和位點，提示不同區(qū)域之間高頻突變基因存在差異，且我們預測NOTCH1 在ESCC 的發(fā)生過程中起到重要作用，可以作為進一步研究的方向。此外，本研究結果為基于廣西地區(qū)ESCC的防治提供指導基礎。