郭 逸，華 川，喻秀蘭，裴 迅，李 揚(yáng)

（湖北省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430070）

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。多數(shù)甲狀腺癌患者經(jīng)治療后預(yù)后良好，但仍有部分患者惡性程度高，易復(fù)發(fā)，預(yù)后不佳[2]。因此，探究甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并尋找有效的治療靶點(diǎn)和治療藥物尤為重要。姜黃素是從姜黃、莪術(shù)、郁金等植物中提取得到的一種天然多酚類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功效[3]。已有報(bào)道稱(chēng)，姜黃素可通過(guò)誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制其生長(zhǎng)[4]；姜黃素可增加甲狀腺癌細(xì)胞中甲狀腺球蛋白和鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白等再分化標(biāo)志物的表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯、凋亡和NF-κB 活性降低，具有抗甲狀腺癌的作用[5]。miR-152是一種微小RNA（miRNA），在非小細(xì)胞肺癌[6]、肝癌[7]和宮頸癌[8]等腫瘤中表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移等惡性行為，是腫瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)。本研究以甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1 為研究對(duì)象，旨在探究姜黃素可否通過(guò)調(diào)控miR-152的表達(dá)影響TPC-1細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

甲狀腺癌細(xì)胞系TPC-1（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；姜黃素，純度＞98%（美國(guó)Sigma公司）；胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；LipofectamineTM2000 試劑盒和Trizol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）；miR-152 抑制劑（anti-miR-152）、抑制劑陰性序列（anti-miR-NC）和PCR 引物（上海生工生物工程有限公司）；兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p21、活化的半胱天冬酶-3（Cleaved-caspases-3）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)蛋白（Bax）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、MMP9 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在超凈工作臺(tái)內(nèi)復(fù)蘇TPC-1細(xì)胞，加含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d 更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至80%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)期TPC-1 細(xì)胞以1.0×105個(gè)/孔TPC-1 細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)基。取滅菌EP管，加250 μL Opti-MEM培養(yǎng)液和6.0 μL Lipofectamine 2000試劑，混合均勻，室溫條件下孵育5 min。另取滅菌EP管，加250 μL Opti-MEM培養(yǎng)液和終濃度為100 nmol/L 的anti-miR-152 或anti-miR-NC，混合均勻，在室溫條件下孵育5 min。將兩管內(nèi)兩種液體混合，在室溫條件下孵育15 min后，取100 μL混合液，緩慢加至6 孔板中。輕輕前后搖晃培養(yǎng)板，混合均勻后，置于培養(yǎng)箱中孵育6 h。棄培養(yǎng)基，換新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)細(xì)胞中miR-152 表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，并收集細(xì)胞備用。

1.2.2 細(xì)胞分組處理 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分為對(duì)照組（NC 組）、低劑量組和高劑量組，其中NC 組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h，低劑量組和高劑量組細(xì)胞分別用含25 μmol/L、50 μmol/L[5]姜黃素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染anti-miR-152、anti-miR-NC 的細(xì)胞均用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為anti-miR-152 組、anti-miRNC組。轉(zhuǎn)染anti-miR-152、anti-miR-NC的細(xì)胞均用含50 μmol/L姜黃素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為高劑量+anti-miR-152組、高劑量+anti-miR-NC組。

1.2.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞以0.5×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，按1.2.2 分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后，加10 μL/孔CCK-8 試劑。孵育2 h 后，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)光密度（OD）值。

1.2.4 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于24 孔板中，按“1.2.2”項(xiàng)分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，并調(diào)整為密度5.0×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液。遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell 上室加100 μL 細(xì)胞懸液，下室加入500 μL 培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定25 min，0.4%結(jié)晶紫染色15 min。顯微鏡觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野，對(duì)遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：先將Matrigel 基質(zhì)膠鋪于Transwell上室，自然晾干后，加100 μL細(xì)胞懸液，后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于24孔板中，按“1.2.2”項(xiàng)分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，參照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.6 Western blotting 法檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于24 孔板中，按“1.2.2”項(xiàng)分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，使用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，并用BCA 法對(duì)蛋白溶液進(jìn)行定量，然后行SDS-PAGE。電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，并于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h。分別置于CyclinD1（1∶500）、p21（1∶500）、Cleaved-caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、MMP2（1∶500）、MMP9（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）一抗孵育液中，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。再置于山羊抗兔二抗（1∶3 000）孵育液中，37 ℃孵育1 h。最后加顯影液避光顯影，曝光拍照。

1.2.7 qPCR檢測(cè)miR-152表達(dá) 細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于24 孔板中，按“1.2.2”項(xiàng)分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，使用Trizol 試劑提取細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃5 min，95 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-152 上游5’-TTTGGCTCTGACCATTCTGT-3’，下游5’-GTCCTCACCTGAGGGACCCC-3’；U6 上游5’-GTCCGAAGTGCGCGGAGAGATCG-3’，下 游5’-TGAGGAGCCCTCGCTTATATGCTC-3’。采用2－△△Ct法計(jì)算miR-152相對(duì)于內(nèi)參U6的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖的影響

與NC 組比較，低劑量組和高劑量組TPC-1 細(xì)胞OD值、CyclinD1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），p21蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。

圖1 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞中CyclinD1、p21蛋白表達(dá)的影響

表1 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖的影響 ，n=9

表1 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖的影響 ，n=9

與NC組比較，*P＜0.05。

2.2 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡的影響

與NC 組比較，低劑量組和高劑量組TPC-1 細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2、圖3、表2。

圖2 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡的影響

圖3 姜黃素對(duì)TPC-1 細(xì)胞中Bax、Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

表2 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡及Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響 ，n=9

表2 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡及Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響 ，n=9

與NC組比較，*P＜0.05。

2.3 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響

與NC 組比較，低劑量組和高劑量組TPC-1 細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)及MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4、圖5、表3。

圖4 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響

圖5 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞MMP2、MMP9蛋白的影響

表3 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響 ，n=9

表3 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響 ，n=9

與NC組比較，*P＜0.05。

2.4 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞中miR-152表達(dá)的影響

與NC組比較，高劑量組TPC-1細(xì)胞中miR-152表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞中miR-152表達(dá)的影響 ，n=9

表4 姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞中miR-152表達(dá)的影響 ，n=9

與NC組比較，*P＜0.05。

2.5 下調(diào)miR-152 降低姜黃素對(duì)TPC-1 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-152 組TPC-1細(xì)胞中miR-152表達(dá)降低（P＜0.05），說(shuō)明下調(diào)miR-152表達(dá)的TPC-1細(xì)胞構(gòu)建成功；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-152 組TPC-1 細(xì)胞OD 值、遷移和侵襲數(shù)及CyclinD1、MMP2 和MMP9 的蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），凋亡率及p21、Cleaved-caspase-3 和Bax的蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與高劑量+anti-miRNC 組比較，高劑量+anti-miR-152 組TPC-1 細(xì)胞中miR-152 表達(dá)降低（P＜0.05），TPC-1 細(xì)胞OD 值、遷移和侵襲數(shù)及CyclinD1、MMP2 和MMP9 的蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），凋亡率及p21、Cleaved-caspase-3和Bax 的蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)圖6、圖7、表5。

表5 下調(diào)miR-152降低姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 ，n=9

表5 下調(diào)miR-152降低姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 ，n=9

與anti-miR-NC組比較，*P＜0.05；與高劑量+anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

圖6 下調(diào)miR-152降低姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞中增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖7 下調(diào)miR-152降低姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡的影響

圖8 下調(diào)miR-152降低姜黃素對(duì)TPC-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響

3 討論

姜黃素是天然的多酚類(lèi)化合物，具有抗腫瘤功能。研究顯示，姜黃素可通過(guò)抑制β-catenin/TCF4信號(hào)途徑降低胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖、侵襲和間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力，并誘導(dǎo)凋亡[9]；姜黃素可通過(guò)下調(diào)p-Akt蛋白，上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)減弱神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[10]；姜黃素可抑制肺癌細(xì)胞A549的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程降低其遷移和侵襲[11]；姜黃素通過(guò)下調(diào)Smad2/3 信號(hào)通路抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）降低了甲狀腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[12]。本研究顯示，25 μmol/L、50 μmol/L的姜黃素可有效降低甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1 的增殖、遷移和侵襲能力，同時(shí)誘導(dǎo)TPC-1 細(xì)胞凋亡，與孫巍[13]和孫麗靜等[14]報(bào)道的結(jié)果一致，說(shuō)明姜黃素具有一定抗甲狀腺癌的作用。

細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等受多種基因的調(diào)控。CyclinD1參與調(diào)控細(xì)胞周期，其表達(dá)增加加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。p21 是目前公認(rèn)的腫瘤抑制因子，其表達(dá)增加降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力。Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行過(guò)程，切割激活caspase-3酶原后，活化的caspase-3發(fā)揮調(diào)控作用，引起細(xì)胞凋亡[16]。Bax是促凋亡蛋白，表達(dá)增加可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MMP2和MMP9是研究最為廣泛的基質(zhì)金屬蛋白酶，其可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[17]。本研究顯示，姜黃素抑制甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1 中CyclinD1、MMP2 和MMP9 的蛋白表達(dá)，而促進(jìn)p21、Cleavedcaspase-3 和Bax 的蛋白表達(dá)(均P＜0.05)，進(jìn)一步說(shuō)明姜黃素可抑制TPC-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，且促進(jìn)TPC-1細(xì)胞凋亡。

miR-152是miR-148/152家族成員之一，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡等生命活動(dòng)，在多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中起重要作用。研究顯示，miR-152 在前列腺癌患者血清中表達(dá)降低，其低表達(dá)與患者臨床分期、是否存在骨轉(zhuǎn)移及病理分期密切相關(guān)[18]；miR-152 可通過(guò)抑制AKT-ERK 信號(hào)通路來(lái)減弱結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移[19]；在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可靶向抑制ROCK1的表達(dá)降低乳腺癌的增殖、遷移和侵襲，miR-152/ROCK1 途徑可能是乳腺癌治療的靶標(biāo)[20]。本研究顯示，下調(diào)miR-152 表達(dá)促進(jìn)了甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1 的增殖、遷移和侵襲能力，且抑制了TPC-1 細(xì)胞凋亡(均P＜0.05)，與Kang等[21]報(bào)道的過(guò)表達(dá)miR-152可抑制TPC-1細(xì)胞增殖和集落形成的結(jié)果一致，提示miR-152 抑甲狀腺癌發(fā)揮抑癌基因作用，可作為甲狀腺癌治療的分子靶點(diǎn)。本研究還顯示，姜黃素可促進(jìn)TPC-1 細(xì)胞中miR-152 的表達(dá)，而下調(diào)miR-152 表達(dá)降低了姜黃素對(duì)TPC-1 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及凋亡促進(jìn)作用(均P＜0.05)，提示姜黃素可能通過(guò)上調(diào)miR-152的表達(dá)來(lái)抑制甲狀腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，姜黃素可有效抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與上調(diào)細(xì)胞中miR-152 的表達(dá)有關(guān)，具有開(kāi)發(fā)為治療甲狀腺癌藥物的潛在價(jià)值。