王麗，馬駿，吳陳華，黃雯靜，高麗，付金蕾，趙童，劉思雨，岳山，劉宇，翟軍軍，朱戰(zhàn)波

1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省牛病防控工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea viruses，BVDV）屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，主要導致牛腹瀉、白細胞減少、持續(xù)性感染、免疫抑制、產奶量降低和生殖問題等［1］，該病呈世界性分布，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經濟損失［2］。BVDV為單股正鏈RNA，通常基于5′-UTR序列、基因組N-端自身蛋白酶（Npro）或包膜糖蛋白（E2）區(qū)域分為BVDV-1和BVDV-2型［3］。有報道，第3種遺傳物種BVDV-3被描述為非典型的BVDV［4］。BVDV-1進一步分為21個亞型（1a～1u），BVDV-2分為3個亞型（2a～2c）。目前中國主要流行8個亞型：1a、1b、1c、1d、1m、1o、1p和1q［5］。

BVDV基因組包括4種結構蛋白（C、E0、E1和E2）和8種非結構蛋白（Npro、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）［6-7］。Npro蛋白為ORF中編碼的第1種蛋白質，具有蛋白酶活性，可從多聚蛋白鏈上自我裂解下來發(fā)揮作用，其Cys69和His130是蛋白酶活性中心的2個位點，可催化Tyr164和Vail65間肽鍵的斷裂。Npro蛋白在瘟病毒屬中具有高度的保守性，可通過比較分析該基因序列對BVDV及瘟病毒屬其他成員的種、群、型進行確定［8］，但目前尚不能完全解釋其蛋白水解作用及免疫抑制機理。本文對BVDV Npro基因進行擴增、生物信息學分析、原核表達及免疫原性檢測，旨在為研究Npro蛋白的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株、細胞及質粒 BVDV-1 NADL株、E.coli DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細胞、pET-28a質粒、pcDNA3.1-Npro質粒、pcDNA3.1空載體、293T細胞均由黑龍江八一農墾大學動物傳染病病原學與生物安全實驗室保存并提供；pMD18-T購自寶日醫(yī)生物技術有限公司。

1.2 實驗動物 SPF級昆明小鼠，6周齡，雌性，體重18～20 g，購自吉林省實驗動物中心，動物合格證號：SCXK2016-0006。

1.3 主要試劑及儀器 高保真Taq酶購自寶日醫(yī)生物技術有限公司；膠回收試劑盒購自北京安諾倫生物科技有限公司；質粒小量提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內切酶、FITC標記的羊抗鼠IgG購自賽默飛世爾科技有限公司；鼠源單抗Anti-His標簽抗體、HRP標記的山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；IPTG購自上海橋星貿易有限公司；Ni-NTA柱購自金斯瑞生物有限公司。

1.4 引物設計及合成 根據GenBank上登錄的BVDV Npro基因（NC-001461.1）設計引物，序列如下：F：5′-CGGAATTCATGGAGTTGATCACAAATGAACTTTTATACAAAACATACA-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點）；R：5′-TGCTCGAGGCAAGTTGTGACCCATAGA-3′（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。BVDV Npro基因全長為504 bp，編碼168 aa。

1.5 Npro基因的擴增 以BVDV-1 NADL株基因組為模板擴增Npro基因。反應體系（50μL）：模板2μL，上下游引物各1μL，10×bufferⅡ5μL，dNTPs5μL，高保真Taq酶1μL，用無菌去離子水補足體積。以2μL無菌去離子水為模板作為陰性對照。反應條件：94℃5 min；94℃30 s，59℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃5 min。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，按膠回收試劑盒說明書純化回收。

1.6 重組克隆質粒p M D-18T-Npro的構建 將純化回收的PCR產物與pMD18-T克隆載體連接，構建pMD18-T-Npro重組質粒，轉化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，涂布氨芐抗性（終濃度100 mg／L）LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)后挑單個菌落繼續(xù)培養(yǎng)12 h；提取質粒進行雙酶切（EcoRⅠ／XhoⅠ）鑒定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7 Npro基因進化樹的構建及生物信息學分析 將目的基因測序進行BLAST同源性分析，用MEGA 6.0軟件采用鄰近法構建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用ExPASy服務器上的ProtParam工具預測蛋白相對分子質量、原子組成、原子數、等電點、親水性或疏水性；采用TMHMM server 2.0在線工具進行跨膜區(qū)預測分析；使用SignalP 4.1服務器對蛋白序列進行信號肽的預測分析；運用Raptor（http：／／raptorx.uchicago.edu／Structure Prediction／predict／）預測蛋白的二級及三級結構。

1.8 重組原核表達質粒的構建 將測序正確的陽性質粒pMD18-T-Npro及pET-28a載體分別經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，膠回收酶切產物，16℃連接過夜；連接產物轉化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，涂布卡那抗性（終濃度100 mg／L）LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)13h；挑取菌落至卡那抗性（終濃度100mg／L）LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h；少量搖菌后小提質粒，進行PCR及雙酶切（EcoRⅠ／XhoⅠ）鑒定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。鑒定正確的陽性質粒命名pET-28a-Npro。

江蘇鄉(xiāng)村旅游起步早，發(fā)展速度快，發(fā)展水平已經從粗放復制走進優(yōu)質提升的新階段，呈現出品質化、特色化、融合化發(fā)展的趨勢。江蘇具有深厚的文化底蘊和得天獨厚的生態(tài)旅游資源，鄉(xiāng)村旅游產品已經從“觀光農家樂”的簡單模式發(fā)展成為“休閑度假”的體驗模式，鄉(xiāng)村旅游已基本形成了依托江南文化底蘊、經營農事、特色農耕文明與現代文明融合發(fā)展的格局，充分滿足了自駕旅游者自由休閑的度假需求。同時，今年清明和端午小長假期間，江蘇各地鄉(xiāng)村旅游市場火爆，根據旅游大數據顯示，鄉(xiāng)村族游中跨省跨市出行比例達56%，每月到鄉(xiāng)村旅游一次的游客比例達46%。

1.9 Npro蛋白的表達及可溶性分析 將鑒定正確的重組表達質粒轉化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取單菌落至氨芐抗性（終濃度100 mg／L）液體LB中，37℃，180 r／min振蕩培養(yǎng)至菌液A600約為0.6時，加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，37℃培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)4 h；收集菌液，7 000×g離心10 min；棄上清，沉淀用PBS（pH 7.4）重懸，冰浴超聲破碎30 min；4℃，10 000×g離心10 min，收集上清及沉淀進行12%SDS-PAGE分析。

1.10 重組蛋白的W es t e rn blot分析 將表達產物經12%SDS-PAGE分離后，經半干轉膜儀轉移至NC膜上，5%脫脂乳室溫封閉2 h；以鼠源單抗Anti-His標簽抗體作為一抗（1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜；TBST洗滌3次，加入HPR標記的羊抗鼠IgG作為二抗（1∶8 000稀釋），室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，DAB顯色。

1.11 重組蛋白的純化及多抗制備 將細菌沉淀用1×PBS重懸，超聲法破碎，4℃，10000×g離心10 min；收集包涵體，1×PBS洗滌包涵體2～3次，LE Buffer溶解包涵體（100 mmol／L Na2HPO4，10 mmol／L Tris-HCl，8 mol／L Urea，pH 8.0），混勻，室溫孵育30～60 min；4℃，12 000×g離心30 min；收集上清，棄沉淀，經0.45μm濾膜過濾后，加入平衡好的Ni-NTA樹脂中，讓樣品緩慢流出，先用5～10倍柱體積的LE Buffer沖洗柱子，再用5～10倍柱體積的Wash Buffer（100 mmol／L Na2HPO4，10 mmol／L Tris-HCl，20 mmol／L imidazole，8 mol／LUrea，pH 8.0）洗滌，最后用Elution Buffer（100 mmol／L Na2HPO4，10 mmol／L Tris-HCl，200 mmol／L imidazole，8 mol／L Urea，pH 8.0）洗脫，每次加入1 mL，收集洗脫液，洗脫至檢出無蛋白。取各管收集液進行12%SDSPAGE分析。按Ni-NTA親和層析說明書純化蛋白。將純化的Npro蛋白與等體積完全弗氏佐劑混勻乳化后，按照50 ng劑量皮下注射小鼠進行初免，每隔2周加強免疫1次，用50 ng重組Npro蛋白與不完全弗氏佐劑1∶1混合分別作為2、3免抗原。3次免疫后第7天，經眼球采血，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.12 多克隆抗體效價的檢測及其蛋白反應原性鑒定 采用ELISA法檢測抗體效價，以純化的Npro蛋白作為包被抗原，4℃過夜包被ELISA板，500 ng／孔；以制備的鼠抗Npro蛋白多克隆抗體為一抗（1∶8 000倍比稀釋），HPR標記的羊抗鼠IgG（1∶8 000稀釋）為二抗，用酶標儀檢測A450值。計算陽性血清與陰性血清的A450比（P／N），當P／N≤1.5為陰性，1.5＜P／N＜2.1為可疑，P／N≥2.1為陽性。將P／N≥2.1時所對應的抗體最高稀釋倍數作為抗體效價。采用Western blot法鑒定免疫原性，具體分析方法同1.10項，用分離血清作為一抗。

1.13 多克隆抗體的特異性鑒定 采用間接免疫熒光試驗，將pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-Npro質粒分別轉染至293T細胞中，用制備的鼠抗Npro多克隆抗體作為一抗（1∶500稀釋），室溫孵育1 h；以FITC標記的羊抗鼠IgG作為二抗（1∶100稀釋），室溫孵育1 h；封片，觀察熒光。

2 結果

2.1 Npro基因P C R擴增產物的鑒定 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在504 bp處可見明顯目的條帶，大小與預期相符，見圖1。

圖1 Npro基因PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of Npro gene

2.2 重組質粒p M D-18T-Npro的鑒定 質粒的雙酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約3 000 bp的載體片段和504 bp的目的基因Npro片段，見圖2。測序結果與原序列一致。

圖2 重組質粒pMD-18T-Npro的雙酶切（EcoRⅠ／XhoⅠ）鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pMD-18TNpro（EcoRⅠ／XhoⅠ）

2.3 Npro基因進化樹的構建及結構預測 將BVDV NADL株Npro基因苷酸序列經NCBI上的BLAST檢索比對，應用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示，NADL株的Npro基因與BVDV V026株Npro基因同源性最近，達99%，并在同一分支，表明NADL株的Npro基因與BVDV V026株Npro基因具有相似的生物學功能，見圖3。利用ExPASy服務器上的Prot-Param工具分析得知，Npro蛋白為親水性蛋白，原子組成C850H1333N239O243S8，原子總數2 673個，共有168個氨基酸，相對分子質量為19 044.87，等電點為9.01；利用TMHMM server 2.0在線工具對Npro蛋白進行跨膜區(qū)分析，顯示Npro蛋白的全部氨基酸位于細胞膜表面，表明Npro是一種外膜蛋白；使用SignalP 4.1服務器對信號肽進行預測分析，發(fā)現該蛋白不存在信號肽；運用Raptor在線工具對二、三級結構進行預測，結果顯示，α螺旋占1%，β折疊占30%，無規(guī)則卷曲占69%，二級結構主要以β折疊與無規(guī)則卷曲為主，見圖4。

圖3 Npro基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Npro gene

圖4 Npro蛋白三維模型構建示意圖Fig.4 Three-dimensional modeling of Npro protein

2.4 重組表達質粒p E T-28a-Npro的鑒定 質粒經PCR及雙酶切鑒定，在504 bp處可見明顯的目的條帶，大小與預期相符，見圖5。測序結果與原序列一致。

圖5 質粒pET-28a-Npro的PCR及雙酶切（EcoRⅠ／XhoⅠ）鑒定Fig.5 Identification of plasmid pET-28a-Npro by PCR and restriction analysis（EcoRⅠ／XhoⅠ）

2.5 表達產物的S D S-P A G E鑒定 結果顯示，在沉淀樣品中能正確表達帶有His標簽的重組Npro蛋白，相對分子質量約25 000，與預期相符，見圖6。

圖6 表達產物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE profile of expressed protein

2.6 表達產物的W es t e rn blot鑒定 結果顯示，表達的重組Npro蛋白能被鼠源Anti-His標簽抗體識別，見圖7。

圖7 Npro蛋白的Western blot鑒定Fig.7 Western blotting of Npro protein

2.7 純化產物的S D S-P A G E鑒定 結果顯示，在相對分子質量約25 000處可見較單一的目的條帶，大小與重組Npro蛋白一致，純度達95%以上，見圖8。

圖8 純化產物的SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE profile of purified protein

2.8 鼠抗Npro蛋白多克隆抗體效價 ELISA結果顯示，當血清稀釋倍數達到1∶128 000時，鼠抗Npro蛋白多克隆抗體的A450為1.457，且P／N>2.1，抗體效價為128 000，見圖9，表明制備的鼠抗Npro蛋白多克隆抗體效價較高。

圖9 多克隆抗體效價的ELISA檢測Fig.9 ELISA of titer of polyclonal antibody

2.9 Npro蛋白的反應原性 Western blot分析顯示，重組Npro蛋白能與鼠抗Npro多克隆抗體血清發(fā)生特異性反應，反應原性較好，而pET-28a誘導菌未發(fā)生特異性反應，見圖10。

圖10 Npro蛋白反應原性的Western blot鑒定Fig.10 Identification of reactogenicity of Npro protein by Western blot

2.10 鼠抗Npro多克隆抗體的特異性 間接免疫熒光試驗結果顯示，抗Npro蛋白能夠識別在293T細胞中表達的Npro蛋白，而轉染pcDNA3.1空載體的細胞中僅見少量非特異性的熒光標記，見圖11。

圖11 鼠抗Npro多克隆抗體特異性的間接免疫熒光試驗（×20）Fig.11 Indirect IFA of specificity of mouse polyclonal antibody against Npro（×20）

3 討論

BVDV屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬成員，包括4種結構蛋白和8種非結構蛋白［9］，而非結構蛋白Npro是瘟病毒的關鍵效應蛋白，具有高度的保守性及蛋白酶活性，但不是病毒復制所必需的。研究表明，BVDV非結構蛋白Npro通過泛素化途徑降解BoELF4負調控Ⅰ型干擾素的表達［10］；使用CSFV Npro的細胞系驗證Npro蛋白的存在使IRF3表達減少，表明瘟病毒特有的這種單一病毒蛋白可在先天免疫系統(tǒng)中抑制干擾素的產生［11］；Npro蛋白在細胞培養(yǎng)中通過抑制Ⅰ型干擾素來干擾先天免疫抑制，這種免疫抑制可能與免疫耐受和BVDV中持續(xù)感染（persistent infection，PI）的發(fā)展有關［12］。但目前尚不能完全解釋其蛋白水解作用及免疫抑制機理。

李慧昕等［13］將BVDV Npro基因克隆至原核表達載體pGEX-6p-1上，并轉化至相應的宿主大腸埃希菌BL21（DE3）中，獲得了高效表達，但用Western blot法未能檢測到蛋白的反應條帶，推測這種蛋白可能存在構象表位。本研究通過PCR法擴增BVDV Npro基因，并將該基因與表達載體pET-28a連接，轉化至大腸埃希菌BL21（DE3）中。該基因在大腸埃希菌中高效表達，并形成包涵體。有研究表明，在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體，可能是由于重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質折疊的酶類和輔助因子、表達的溫度不適合、二硫鍵不能正確配對、蛋白質無法達到足夠的溶解度等［14］。宮曉煒［15］通過間接免疫熒光試驗和Western blot法檢測BVDV細胞中感染的病毒粒子和表達的病毒蛋白，結果證實兔抗Npro多克隆抗體具有較高的親和力。本研究用Npro蛋白免疫小鼠，制備Npro多克隆抗體，通過間接免疫熒光試驗和Western blot法證明制備的鼠抗Npro多克隆抗體能與重組Npro蛋白發(fā)生特異性反應，與宮曉煒［15］的研究結果一致。

本研究采用生物信息學方法對BVDV Npro蛋白進行生物信息學分析，并進行了原核表達及多克隆抗體制備，結果表明，Npro是一種外膜蛋白，具有親水性，不存在信號肽，二級結構主要以β折疊與無規(guī)則卷曲為主；成功構建了pET-28a-Npro重組質粒并表達了重組Npro蛋白，純化后蛋白純度達95%，可被鼠源Anti-his標簽抗體識別；制備的多克隆抗體具有較好的特異性。但目的蛋白以包涵體形式存在，給后續(xù)蛋白純化及純化后蛋白的復性帶來難度，因此，在后續(xù)試驗中，我們將對原核表達條件進行優(yōu)化，如誘導時間、溫度、誘導劑濃度及表達載體等，以期使目的蛋白以可溶性形式表達，為后續(xù)進一步研究BVDV Npro蛋白的功能奠定基礎。