李欣，魏靜，蔣如如，哈小琴

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院臨床檢驗診斷學(xué)，甘肅 蘭州 730030；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院檢驗科，甘肅 蘭州 730050；

20世紀70年代提出了基因治療的方法，近年逐步顯示出良好的臨床效果。多數(shù)情況下，基因治療是將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入靶細胞以達到治療目的［1］?；蛑委熡捎谏贁?shù)患者出現(xiàn)嚴重副作用，使其應(yīng)用受限，隨著對基因相關(guān)分子和細胞機制的深入了解，研發(fā)了復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)移工具，極大提高了基因治療的安全性和治療效果［2］。

減毒沙門菌作為基因治療的活載體，具有巨大的研發(fā)潛力，在人類和獸醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛，隨著對細菌的遺傳學(xué)、生物學(xué)和致病機理的深入了解，使針對特定應(yīng)用沙門菌構(gòu)造的設(shè)計更合理［3］。本實驗采用的減毒沙門菌為減毒傷寒沙門菌Ty21a，是目前唯一用于制備人類疾病預(yù)防產(chǎn)品的減毒疫苗株，可提高機體免疫力，安全性較高［4］。Ty21a的致病性雖較低，但仍具有較高的侵襲性，口服后可在胃腸道黏膜定植［5］。針對該特性，本課題組前期實驗將角質(zhì)細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）及低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）基因連接至質(zhì)粒p IRES-SEQ中，構(gòu)建重組質(zhì)粒p IRESHIF-IRES-KGF，電轉(zhuǎn)入減毒沙門菌Ty21a中，成功構(gòu)建了攜帶KGF及HIF-1α雙基因的減毒沙門菌（Ty21a-pIRES-HIF-KGF，TPKH）。KGF可促進上皮細胞增殖，具有維持和恢復(fù)受損傷胃腸黏膜的完整性的作用［6］；HIF-1α可使缺氧組織細胞保持一定的氧濃度，使細胞能耐受低氧狀態(tài)而存活［7］。由于質(zhì)粒p IRES-SEQ含有氨芐青霉素（Amp）基因位點，TPKH既可在Amp（+）LB平板上生長，以此篩選陽性菌落，又可在Amp（-）LB平板上生長。本實驗通過目的基因片段的大小和目的蛋白的表達水平來評價TPKH的遺傳穩(wěn)定性，為后續(xù)大量生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及細胞 攜帶KGF和HIF-1α雙基因的TPKH由甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室提供；大鼠小腸上皮隱窩細胞（intestinal crypt cells，IEC-6）購自中國科學(xué)院上海細胞庫；Ty21a菌株購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 主要試劑 Premix TaqTM、DNA marker DL2000及500 bp DNA marker購自日本TaKaRa公司；瓊脂糖、TAE電泳緩沖液及質(zhì)粒小提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；SuperRed／GelRed核酸染色液購自北京白鯊生物技術(shù)有限公司；氨芐西林鈉購自石家莊華北制藥集團；鼠KGF及鼠HIF-1αELISA試劑盒購自上海江萊生物有限公司；革蘭染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS）購自美國Gibco公司。

1.3 菌株傳代 取100μL初始代TPKH菌株，接種于10 mL的LB培養(yǎng)液中，于37℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)至A600約0.6時，取100μL菌液，采用四區(qū)劃線法分別涂布于Amp（+）和Amp（-）的LB固體培養(yǎng)板上，置37℃孵箱中培養(yǎng)24 h；分別取生長良好的單克隆菌落，置10 mL Amp（+）和Amp（-）的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)至A600約0.6，即為第1代菌株。按該方法連續(xù)傳40代。

1.4 菌體及菌落形態(tài)觀察 肉眼觀察10、20、30、40代菌落形態(tài)。同時取1滴0.9%氯化鈉溶液置于蓋玻片上，用接種環(huán)挑取10、20、30、40代菌落，加入0.9%氯化鈉溶液中，制作涂片，置酒精燈上方快速過3次，固定，進行革蘭染色，立即鏡下觀察。

1.5 菌落P C R檢測 挑取5、10、15、20、25、30、35、40代菌落至0.2 mL PCR管中，加入10μL滅菌蒸餾水，混勻，蓋緊。100℃煮沸5 min，-20℃冷凍5 min，重復(fù)2次。2 795×g離心5 min，取上清，作為DNA模板，進行目的基因和真核表達啟動子CMV的擴增。啟動子CMV上游引物：5′-CCCAGTACATGACCTTATGGG-3′，下游引物：5′-GGAGACTTGGAAATCCCC-GT-3′，擴增產(chǎn)物大小為140 bp；KGF基因上游引物：5′-TGATCTAGAATGAGCTATGATTACATGGAAG-3′，下游引 物：5′-GACGCGGCCGCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3′擴增產(chǎn)物大小為443 bp；HIF-1α基因上游引物：5′-CATGCTAGCCACCGATTCACCATGGAGGGC-3′，下游引物：5′-GTCACGCGTTCAGTTAACTTGATCC-AAAGCTCTG-3′，擴增產(chǎn)物大小為2 492 bp。PCR反應(yīng)體系為：Premix Taq 25μL，cDNA模板1μg，上、下游引物各1μL，滅菌蒸餾水補充至50μL。PCR擴增條件為：95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 質(zhì)粒濃度及純度的測定 取10、20、30、40代菌落各1 mL，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過紫外分光光度計測定A260及A280值，計算濃度和純度。

1.7 轉(zhuǎn)染時間對I E C-6細胞中K G F和H I F-1α蛋白表達水平影響的檢測 將初始代TPKH和Ty21a菌落分別接種于10 mL LB Amp（+）和Amp（-）液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫搖床中培養(yǎng)至A600為0.6時，2 795×g離心10 min，D-PBS洗滌3次，調(diào)整菌液濃度為1×108cfu／mL。將1×106個IEC-6細胞接種于25 cm2細胞瓶中，待細胞貼壁后，分別接種TPKH和Ty21a菌株，同時設(shè)PBS組，于37℃孵育2 h；棄菌懸液，D-PBS洗滌3次，加入含10 ng／mL慶大霉素的DMED培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h；D-PBS洗滌3次，加入含青-鏈霉素雙抗的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，于培養(yǎng)12、24、48、72 h時，采用鼠KGF及HIF-1αELISA試劑盒分別檢測KGF和HIF-1α蛋白的表達水平。

1.8 T P KH代次對I E C-6細胞中K G F和H I F-1α蛋白表達水平影響的檢測 取初始代、10、20、30、40代TPKH菌落，按1.7項方法接種至IEC-6細胞，同時設(shè)PBS組，培養(yǎng)48 h，采用鼠KGF及HIF-1αELISA試劑盒分別檢測KGF和HIF-1α蛋白的表達水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗結(jié)果均采用均值±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌體及菌落形態(tài) 10、20、30和40代TPKH在Amp（+）和Amp（-）LB平板上的菌落形態(tài)基本一致，均為邊緣整齊，淡黃色、半透明，光滑濕潤的圓形菌落，均為革蘭陰性，見圖1和圖2。

圖1 Amp（+）培養(yǎng)基中各代TPKH菌落及菌體形態(tài)Fig.1 Morphology of TPKH of various passages in Amp（+）medium

圖2 Amp（-）培養(yǎng)基中各代TPKH菌落和菌體形態(tài)Fig.2 Morphology of TPKH of various passages in Amp（-）medium

2.2 菌落P C R在Amp（+）和Amp（-）的LB平板上培養(yǎng)的TPKH菌落，均可擴增出140、443及2 492 bp的CMV、KGF及HIF-1α基因片段，大小與預(yù)期一致，見圖3和圖4。表明TPKH在傳代過程中無質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，可穩(wěn)定遺傳。

圖3 Amp（+）培養(yǎng)基中各代TPKH菌落PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretic profile of colony PCR products of TPHK of various passages in Amp（+）medium

圖4 Amp（-）培養(yǎng)基中各代TPKH菌落PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretic profile of colony PCR products of TPHK of various passages in Amp（-）medium

2.3 質(zhì)粒濃度及純度TPKH菌株在Amp（+）和Amp（-）培養(yǎng)基的傳代過程中，質(zhì)粒p IRES-HIF-IRES-KGF的濃度及純度均較穩(wěn)定，無明顯降低，見表1。

表1 各代TPKH菌落中質(zhì)粒的濃度及純度Tab.1 Concentration and purity of plasmid in TPKH colonies of various passages

2.4 轉(zhuǎn)染時間對I E C-6細胞中K G F和H I F-1α蛋白表達水平的影響 與PBS組和Ty21a組比較，TPKH組IEC-6細胞中KGF蛋白表達水平在轉(zhuǎn)染后12 h顯著升高（F=9.702，P＜0.01），隨后逐漸降低（F=0.020～9.690，P＞0.05）；HIF-1α蛋白表達水平于轉(zhuǎn)染后12、24、48 h均顯著升高（F=21.186～24.559，P＜0.01），72 h降低（F=4.639，P＞0.05）。見圖5。

圖5 不同轉(zhuǎn)染時間時IEC-6細胞中KGF（A）和HIF-1α（B）蛋白的表達水平Fig.5 Expression levelsof KGF（A）and HIF-1α（B）in IEC-6 cells after infection for various hours

2.5 T P KH代次對I E C-6細胞中K G F和H I F-1α蛋白表達水平的影響 與PBS組比較，各代TPKH接種IEC-6細胞中的KGF及HIF-1α的蛋白表達水平均明顯增加（F=285.616～92.114，P＜0.01）；各代間的KGF及HIF-1α的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.851～1.846，P＞0.05），見圖6。表明代次對TPKH轉(zhuǎn)染細胞后的蛋白表達水平無明顯影響。

圖6 不同代次TPKH感染IEC-6細胞中KGF（A）和HIF-1α（B）蛋白的表達水平Fig.6 Expression levelsof KGF（A）and HIF-1α（B）in IEC-6 cells infected with TPKH of various passages

3 討論

機體遭受嚴重創(chuàng)傷、燒傷、感染時可引起機體缺血、缺氧，從而誘發(fā)急性胃腸黏膜糜爛、潰瘍，甚至出血和穿孔，該現(xiàn)象稱為胃腸應(yīng)激損傷，是一種較常見的臨床疾病［8］。雖然目前的防治方法較多，如抗生素及中藥治療等，但療效均不佳。研究證實，KGF及HIF-1α能夠在機體缺血、缺氧的狀態(tài)下促進胃腸上皮細胞增殖、局部血管形成及胃腸道黏膜損傷愈合等，具有良好的防治缺血、缺氧引起胃腸應(yīng)激損傷的功能［9-10］。

KGF是成纖維細胞生長因子家族的一員，又稱為成纖維細胞生長因子7（fibroblast growth factor-7，KGF7），是一種間充質(zhì)細胞衍生的旁分泌生長因子，參與表皮的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)［11］。研究證實，在低氧狀態(tài)下，KGF對胃腸上皮細胞生長和維持有許多有益的作用，既能夠增強胃腸上皮的屏障功能，又能促進胃腸上皮細胞的增殖，減輕胃腸黏膜損傷［12］。HIF-1α是HIF-1的亞基，可被低氧誘導(dǎo)，常氧下含量較少，當機體處于低氧狀態(tài)時，HIF-1能夠高表達［13］。近年研究證實，在缺氧狀態(tài)下，HIF-1參與血管生成、葡萄糖代謝、細胞增殖、細胞存活等生理反應(yīng)，增加機體對缺氧的耐受性，保護機體免受低氧的損傷［14-16］。

本實驗將TPKH在Amp（+）和Amp（-）的LB平板上連續(xù)傳40代后，多項檢測結(jié)果表明，每10代間菌體和菌落的形態(tài)基本一致，均符合沙門菌的形態(tài)特征；質(zhì)粒濃度穩(wěn)定，變化較小，表明傳代次數(shù)對減毒沙門菌的生長不產(chǎn)生影響，質(zhì)粒不會隨著傳代而丟失；傳代后TPKH每5代均可擴增出KGF、HIF-1α、CMV基因片段（分別為443、2 492和140 bp），表明在傳代過程中，KGF和HIF-1α不會隨傳代次數(shù)的增加而丟失。另外，初始代TPKH轉(zhuǎn)染IEC-6細胞后，KGF和HIF-1α蛋白水平轉(zhuǎn)染12 h時顯著上升（P＜0.01），每10代間的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明傳代次數(shù)不影響TPKH轉(zhuǎn)染細胞后KGF和HIF-1α蛋白的表達。

綜上所述，TPKH的遺傳穩(wěn)定性較好，在連續(xù)傳代40代后，仍能穩(wěn)定表達其所攜帶的目的基因，本實驗為TPKH制劑的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。