袁明翠，張啟書(shū)，李維冉，葉超，謝航航，黃惟巍，馬雁冰

1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118

OX40（也被稱作CD134／TNFRSF4）是第二代免疫檢查點(diǎn)的代表性靶點(diǎn)之一。相比于CTLA-4及PD-1等共抑制分子，OX40屬于T細(xì)胞表面的共刺激分子，廣泛表達(dá)于炎癥及腫瘤部位［1］。OX40是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，包括膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)3部分，其胞外段含有4個(gè)NGFR樣結(jié)構(gòu)，為半胱氨酸富集區(qū)，通過(guò)二硫鍵形成便于與配體結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)域［2］。小鼠和人OX40主要在活化的T細(xì)胞上表達(dá)，也包括自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，其配體OX40L（也被稱作CD252）則表達(dá)于活化的抗原呈遞細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等［3］。通過(guò)傳遞協(xié)同刺激信號(hào)，OX40使得活化的效應(yīng)T細(xì)胞增殖及存活，同時(shí)有助于記憶T細(xì)胞的生成［4-6］。另外，OX40在腫瘤中可降低Treg細(xì)胞的活性，進(jìn)而維持效應(yīng)T細(xì)胞的功能［7-8］。在一些小鼠模型中，激動(dòng)型OX40特異性單克隆抗體可消耗Treg細(xì)胞［9-10］。聯(lián)合使用OX40特異性激動(dòng)型抗體和抑制信號(hào)通路的阻斷劑，可活化CD8+T細(xì)胞并分泌高水平IFNγ和顆粒酶B，進(jìn)而抑制Treg細(xì)胞［11-14］。OX40激動(dòng)型抗體對(duì)Treg細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞的不同調(diào)節(jié)作用，有助于機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［4，15-16］。

本研究旨在構(gòu)建呈現(xiàn)小鼠OX40抗原表位的病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs），為進(jìn)一步以主動(dòng)免疫方式靶向OX40調(diào)控T細(xì)胞免疫功能，進(jìn)行疾病干預(yù)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株 大腸埃希菌（E.coli）DH5α及表達(dá)修飾的乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）的質(zhì)粒pHBcAg為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所分子免疫室保存，pHBcAg在對(duì)應(yīng)HBcAg第78與79位氨基酸的核苷酸序列之間引入了BamHⅠ與EcoRⅠ位點(diǎn)，允許編碼抗原的寡核苷酸片段插入。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB／c雌性小鼠，6～8周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCK（京）2016-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（京）2017-0033。飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房。

1.3 主要試劑及儀器 質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒及純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；EcoRⅠ、BamHⅠ、NdeⅠ、PstⅠ、T4 DNA連接酶、蛋白質(zhì)marker、DNA marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；改良型Bradford蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，OX40蛋白由該公司合成；IPTG購(gòu)自美侖生物技術(shù)有限公司；蔗糖購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；Alum佐劑、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG及酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；Sephadex G25填料、Sepharose 4 Fast Flow凝膠購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.4 小鼠OX 40胞外段抗原表位預(yù)測(cè) 按GenBank中登錄的小鼠氨基酸序列（P47741），利用網(wǎng)站進(jìn)行抗原表位分析。其原理是基于對(duì)已知抗原表位統(tǒng)計(jì)獲得的各種氨基酸出現(xiàn)的頻率數(shù)據(jù)對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行分析，根據(jù)肽段中氨基酸頻率大小預(yù)測(cè)出具有抗原性潛能的肽段，分析網(wǎng)站（http：／／imed.med.ucm.es／Tools／antigenic.pl）。主要靶向區(qū)域?yàn)镺X40胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域，編碼抗原肽的寡核苷酸序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用TE Buffer將合成的寡核苷酸溶解后，將正負(fù)鏈（50μmol／L）等量混合，置95℃熱水中緩慢冷卻至室溫，形成編碼抗原肽的雙鏈DNA片段，并有BamHⅠ和EcoRⅠ的黏性末端暴露于兩端。將質(zhì)粒pHBcAg用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，膠回收載體片段，與編碼抗原肽的雙鏈DNA片段混合，經(jīng)T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，0.1%氨芐西林篩選陽(yáng)性克隆，質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切（NdeⅠ／EcoRⅠ）鑒定正確后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含0.1%氨芐西林的LB平板，37℃培養(yǎng)；挑取單菌落接種至5mLLB（Amp+）液體培養(yǎng)基，37℃，180 r／min培養(yǎng)過(guò)夜；按1∶50比例轉(zhuǎn)接至新鮮LB（Amp+）培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床37℃，220 r／min培養(yǎng)4 h；至A600約0.6時(shí)，調(diào)節(jié)搖床溫度至28℃，加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h；4℃，8 000×g離心10 min，收集菌體，進(jìn)行15%SDS-PAGE分析。

1.7 重組蛋白的純化 每1 L菌液收集的菌體用10 mL PBS（20 mmol／L PB，150 mmol／L NaCl，pH 7.2）緩沖液重懸，冰水浴下進(jìn)行超聲破碎，超聲總時(shí)間10 min，每次5 s，間隔10 s；4℃，17 000×g離心15 min，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行15%SDS-PAGE分析。

1.7.1 超聲裂解上清中目的蛋白的純化 收集上清加入硫酸銨至飽和度為40%，室溫放置30 min；20℃，17 000×g離心20 min；棄上清，沉淀用飽和度20%的硫酸銨溶液洗滌5次，每次均20℃，17 000×g離心10 min；棄上清，沉淀用PBS重懸，蔗糖密度梯度離心（蔗糖梯度溶液從上至下依次為10%、20%、30%、40%和50%）后，用Sepharose 4 Fast Flow凝膠層析分離（2.5 cm×100 cm，流速為0.5 mL／min，緩沖液為PBS），收集樣品進(jìn)行15%SDS-PAGE分析。Bradford法測(cè)定蛋白濃度，0.22μm濾器過(guò)濾除菌后，于-80℃保存。

1.7.2 超聲裂解沉淀中目的蛋白的純化 收集沉淀，用低濃度變性劑（0.5、1、2 mol／L尿素以及2%Triton X-100）分別洗滌3次，考察對(duì)雜蛋白的洗滌效果及目的蛋白損失；以4、6、8 mol／L尿素分別溶解沉淀，考察目的蛋白溶解情況；用PBS分別進(jìn)行2、4、8倍稀釋，室溫20℃靜置2 h，考察尿素濃度降低沉淀產(chǎn)生情況；27 000×g離心20 min，收集上清，經(jīng)0.45μm濾器過(guò)濾，用Sephadex G25凝膠層析脫鹽，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，0.22μm濾器過(guò)濾除菌，于-80℃保存。

1.8 VLP s形態(tài)觀察 將純化的嵌合蛋白樣品經(jīng)2%磷鎢酸染色后，透射電鏡下觀察VLPs形態(tài)。

1.9 小鼠免疫 將VLPs與Alum佐劑在旋轉(zhuǎn)混合儀上混合，4℃，360度緩慢旋轉(zhuǎn)1 h后，每只小鼠背部皮下免疫100μL（含50μg抗原蛋白及4 mg Alum），2周1次，共3次，每劑接種后1周腿靜脈采血，分離血清。

1.10 小鼠血清抗體水平檢測(cè) 采用ELISA法。將OX40蛋白包被96孔板，100μL／孔，4℃過(guò)夜；PBST洗滌3次，2%BSA 37℃封閉2 h；PBST洗滌3次，加入小鼠免疫血清（1∶5 000稀釋），37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶5 000稀釋），37℃孵育1 h；PBST洗滌5次，TMB顯色，37℃孵育15～30 min；酶標(biāo)儀檢測(cè)A450和A620，結(jié)果為A450-A620值。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測(cè)的抗原表位 經(jīng)預(yù)測(cè)共獲得7個(gè)潛在的抗原表位，為P1～P7。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析，獲得的重組質(zhì)粒目的條帶略大于載體質(zhì)粒。pHBcAg（NP）對(duì)應(yīng)條帶，產(chǎn)物大小為分別為297和276 bp，與預(yù)期相符，見(jiàn)圖1（以P6為例），測(cè)序結(jié)果證明構(gòu)建正確。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切（NdeⅠ／EcoRⅠ）鑒定Fig.1 Restriction map of recombinant plasmids（NdeⅠ／EcoRⅠ）

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 15%SDS-PAGE分析顯示，重組菌均有效表達(dá)了目的蛋白（P1～P7），其理論相對(duì)分子質(zhì)量分別約為19 000、18 900、18 600、19 000、18 700、19 000和18 600，由于抗原肽的插入而略大于NP編碼的蛋白HBcAg（理論相對(duì)分子質(zhì)量約為17 500），見(jiàn)圖2。

圖2 表達(dá)的重組P1～P7蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig.2 SDS-PAGE profile of expressed recombinant P1～P7 proteins

2.4 純化產(chǎn)物的鑒定

2.4.1 超聲裂解上清中重組蛋白的純化 重組蛋白P3、P6和P7存在于可溶性上清中，經(jīng)硫酸銨沉淀及洗滌步驟可去除部分雜蛋白。經(jīng)蔗糖密度梯度離心后，SDS-PAGE分析表明，目的蛋白得到進(jìn)一步純化并主要存在于8～10層，見(jiàn)圖3（以P6為例），與天然形式的HBcAg一致，表明可能以HBcAg VLPs形式存在；取7～11層蛋白經(jīng)Sepharose 4 Fast Flow凝膠層析純化后（見(jiàn)圖4，以P6為例），取峰2進(jìn)行SDS-PAGE分析，目的蛋白條帶大小與預(yù)期相符，見(jiàn)圖5（以P6為例）。

圖3 裂解上清中純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profile of purified protein in supernatant

圖4 7～11層蛋白Sepharose 4 Fast Flow凝膠層析純化圖譜Fig.4 Purification of proteins in layers 7～11 of sucrose density gradient centrifugation by Sepharose 4 Fast Flow gel chromatography

圖5 Sepharose 4 Fast Flow凝膠層析純化產(chǎn)物的SDSPAGE分析Fig.5 SDS-PAGE profile of protein purified by Sepharose 4 Fast Flow gel chromatography

2.4.2 超聲裂解沉淀中重組蛋白的純化 重組蛋白P1、P2、P4和P5存在于沉淀中，經(jīng)低濃度的變性劑洗滌后可去除部分雜蛋白，見(jiàn)圖6（以P5為例）。但以尿素洗滌雜蛋白，目的蛋白損失較大，而以2%Triton X-100洗滌雜蛋白去除效果明顯且目的蛋白損失少。沉淀經(jīng)4 mol／L尿素溶解，即可達(dá)到有效溶解的目的，而稀釋至0.5 mol／L尿素也未產(chǎn)生明顯沉淀。離心上清經(jīng)15%SDS-PAGE分析，在相對(duì)分子質(zhì)量約18 000處可見(jiàn)與目的蛋白相符的條帶，見(jiàn)圖7（以P5為例）。進(jìn)一步的電鏡觀察顯示，4 mol／L尿素溶解沉淀后樣品可見(jiàn)大量VLPs存在。因此，確定后續(xù)VLPs制備條件為：經(jīng)2%Triton X-100洗滌沉淀，以4 mol／L尿素溶解，并以PBS進(jìn)行8倍稀釋。

圖6 沉淀經(jīng)低濃度去垢劑洗滌純化后產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE profile of purified protein washed with low concentration detergent

圖7 沉淀經(jīng)2%Triton X-100洗滌、尿素溶解、PBS稀釋后產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE profile of precipitate washed with 2%TritonX-100，dissolved in urea and diluted with PBS

2.5 VLPs的電鏡觀察 結(jié)果顯示，重組蛋白P1～P7均形成直徑約30 nm的VLPs，且形態(tài)、大小與原始HBcAg VLPs相似。見(jiàn)圖8。

圖8 VLPs的透射電子顯微鏡觀察Fig.8 Transmission electron microscopy of VLPs

2.6 小鼠血清OX 40特異性抗體水平 ELISA結(jié)果顯示，重組蛋白免疫后的小鼠抗血清可與OX40蛋白發(fā)生不同程度的特異性反應(yīng)，見(jiàn)圖9，抗體動(dòng)態(tài)應(yīng)答圖見(jiàn)圖10（以P6為例），抗體滴度可達(dá)128 000，見(jiàn)圖11（以P6為例）。

圖9 血清特異性抗體應(yīng)答分析Fig.9 Serum specific antibody responses induced by recombinant proteins in mice

圖10 P6 3次免疫血清特異抗體應(yīng)答動(dòng)力學(xué)Fig.10 Kinetics of serum specific antibody response induced by immunization with P6 for 3 times

圖11 重組蛋白免疫后的小鼠血清抗體滴度Fig.11 Serum antibody titers of mice immunized with recombinant proteins

3 討論

B細(xì)胞抗原表位可被B細(xì)胞表面受體（B-cell receptor，BCR）或抗體Fab部分特異性識(shí)別并結(jié)合，是體液免疫的物質(zhì)基礎(chǔ)。多肽表位的大小一般為5～15個(gè)氨基酸。隨著線性B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)方法的不斷增加，節(jié)約了大量的實(shí)驗(yàn)室工作，避免了傳統(tǒng)表位研究的盲目性，為免疫診斷和免疫治療提供了便利［17］。本實(shí)驗(yàn)是基于氨基酸在抗原中出現(xiàn)的頻率對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，準(zhǔn)確率可達(dá)60%～70%，結(jié)合肽段的親水性、疏水性分析以及蛋白三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，可達(dá)到更高的效率。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因重組將預(yù)測(cè)得到的OX40抗原表位插入至HBcAg VLPs，利用VLPs獨(dú)特的結(jié)構(gòu)及免疫學(xué)特點(diǎn)，賦予肽表位強(qiáng)免疫原性，為抗原表位的快速分析鑒定提供了一個(gè)平臺(tái)。旨在利用主動(dòng)免疫策略激發(fā)特異抗體應(yīng)答，為靶向調(diào)控OX40提供有效手段。與之相比，單克隆抗體、可溶性受體等被動(dòng)免疫制劑由于半衰期短，需要反復(fù)給藥，且價(jià)格昂貴等，在研究及臨床應(yīng)用中具有局限性。本文利用重組HBcAg VLPs作為疫苗載體，具有以下優(yōu)勢(shì)：可在大腸埃希菌中高效表達(dá)，并自我組裝成VLPs；易于純化、制備；納米顆粒結(jié)構(gòu)及抗原表位在顆粒表面的高度有序重復(fù)排列，高效刺激了抗原遞呈細(xì)胞對(duì)抗原肽的攝取、加工及呈遞，從而賦予肽表位強(qiáng)免疫原性，即使不用常規(guī)佐劑也能激發(fā)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。

靶向檢查點(diǎn)分子的免疫治療藥物并不直接作用于癌細(xì)胞，而是通過(guò)作用于免疫細(xì)胞，促進(jìn)對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)；而且，免疫治療藥物并不是針對(duì)癌細(xì)胞表面的某些特定物質(zhì)，而是系統(tǒng)性地增強(qiáng)了全身的抗腫瘤免疫應(yīng)答。OX40是極有希望的新一代檢查點(diǎn)療法靶向分子，其是表達(dá)于細(xì)胞毒性T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的活化受體，激動(dòng)型的OX40抗體為CD8+T殺傷細(xì)胞和CD4+T輔助細(xì)胞的增殖及擴(kuò)增提供了刺激信號(hào)，同時(shí)也對(duì)Treg產(chǎn)生抑制［11］。OX40主要在CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞或中性粒細(xì)胞中表達(dá)，而OX40L在樹(shù)突細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表達(dá)。早期臨床前研究顯示，OX40能刺激包括肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌等腫瘤免疫原性模型，激起抗腫瘤作用［4-5，18-20］，但單藥對(duì)弱免疫原性模型效果一般。后續(xù)研究將利用構(gòu)建的VLPs激發(fā)OX40特異抗體，鑒定其對(duì)OX40信號(hào)通路及靶細(xì)胞的作用，并考察其在腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用，還將重點(diǎn)考察其對(duì)腫瘤疫苗作用的協(xié)同性，為腫瘤免疫治療提供新的手段及策略。