張 亮

(甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 武威733006)

攜帶一些特殊血清的大腸桿菌中可導(dǎo)致人和動物患病，常常引起嬰兒和幼畜(禽)嚴(yán)重腹瀉和敗血癥。中國藥典2010版收錄了一種名為番瀉葉的瀉下導(dǎo)滯藥之一，番瀉葉是由豆科植物狹葉番瀉或者光葉番瀉的干燥小葉組成。灌胃番瀉葉可誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)的濕熱毒素下行，經(jīng)腸道排出體外，從而損傷大腸。因此，本實(shí)驗(yàn)是用高溫高濕+大腸桿菌組，高溫高濕+番瀉葉組，高溫高濕組等來模擬大鼠大腸濕熱泄瀉模型，觀察大鼠的腹瀉指數(shù)(稀便率+稀便指數(shù))，臨床表現(xiàn)(行為學(xué)、飲水量、采食量、體重、體溫、尿量)來判斷是否成功建立濕熱泄瀉模型，從三種方法中選擇何種方法更適合用于建立中獸醫(yī)大腸濕熱證的模型，為進(jìn)一步闡明大腸濕熱證發(fā)病的病因、機(jī)理及其特點(diǎn)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑

產(chǎn)毒性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(菌號：44711)、蜂蜜水(20%)、白酒(二鍋頭56°)、豬油、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、生理鹽水、新潔爾滅、蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

KMD型調(diào)溫電熱套；多用真空泵(鄭州)；RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀； SHA-B恒溫振蕩器；KQ-300ED型數(shù)控超聲清洗器；大鼠代謝籠；烘干箱；壓力蒸汽滅菌器、恒溫水浴鍋?zhàn)⑸淦?、試管架等?/p>

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計與方法

2.1 高溫倉的搭建

自制高溫倉，模擬夏季高溫高濕環(huán)境，溫度范圍(35±1℃)，濕度范圍(85%～90%)。

2.2 番瀉葉水煎液的制備

采購自蘭州黃河藥材市場的番瀉葉樣品稱取400 g，加1200 mL蒸餾水浸泡和煮沸各1 h，取上清液，濾渣加蒸餾水600 mL，煮沸0.5 h，取上清液，合并兩次上清液，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至300 mL，然后用蒸餾水定容至400 mL，使其相當(dāng)于含生藥 1 g/mL，保存于4℃冰箱中備用。

2.3 培養(yǎng)基的制備

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基制作：混合牛肉膏3 g、NaCl5 g、蛋白胨10 g。加熱充分溶解于1 000 mL蒸餾水中，并分裝于三角瓶中，調(diào)pH至7.2，121℃高壓滅菌15 min，塞緊瓶塞，4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

瓊脂培養(yǎng)基制作：混合蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，NaCl5 g和瓊脂15 g，將混合物充分溶解于1 000 mL蒸餾水中，加熱至完全溶解，分裝至三角瓶中，并于121℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min，在超凈工作臺倒板，4℃無菌保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 大腸桿菌的培養(yǎng)

經(jīng)過細(xì)菌復(fù)蘇、平板篩選、傳代培養(yǎng)使用麥?zhǔn)媳葷岱y定大腸桿菌，并用生理鹽水稀釋濃度至1×109mol/L。

2.5 動物分組與造模

由甘肅中醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供的實(shí)驗(yàn)動物體重為160～180 g，雌雄 SD大鼠各20 只。用普通滅菌飼料飼喂大鼠，自由飲食和光照，保持溫度為20～30℃，濕度40%～60%，3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

采用完全隨機(jī)分組法將大鼠分為空白組，高溫高濕組，高溫高濕+番瀉葉組和高溫高濕+大腸桿菌組。每組大鼠10只，其中雌鼠和雄鼠各5只。

空白組：飼喂普通飼料，自由飲食，自然光照

高溫高濕模型組：單日飼喂普通飼料，雙日禁食并對每只大鼠灌胃2mL豬油，每日給予足量的20%蜂蜜水。持續(xù)10 d；在第11天移入高溫高濕倉(溫度為35±1℃；相對濕度為85%～90%)內(nèi)8 h，每日飼喂普通飼料，并給予足量的白開水，持續(xù)5 d，第16 天每只大鼠灌胃2 mL蒸餾水，24 h后重復(fù)一次。

高溫高濕+番瀉葉模型組：單日飼喂普通飼料，雙日禁食并對每只大鼠灌胃2 mL豬油，每日給予足量的20%蜂蜜水。持續(xù)10 d；在第11天移入高溫高濕倉(溫度為35±1℃；相對濕度為85%～90%)內(nèi)8 h，每日飼喂普通飼料，并給予足量的白開水，持續(xù)5 d，第16 天每只大鼠灌胃2 mL 0.05 g/mL的番瀉葉水煎液，直到100%腹瀉。

高溫高濕+大腸桿菌模型組：單日飼喂普通飼料，雙日禁食并對每只大鼠灌胃2 mL豬油，每日給予足量的20%蜂蜜水。持續(xù)10 d；在第11 天移入高溫高濕倉(溫度為35±1℃；相對濕度為85%～90%)內(nèi)8 h，每日飼喂普通飼料，并給予足量的白開水，持續(xù)5 d，第16天每只大鼠腹腔注射0.3 mL濃度為1×109mol/L的大腸桿菌懸液，24 h后重復(fù)一次。

所有模型組和空白組大鼠在造模完成后，觀察一天，并禁食不禁水24 h。

2.6 檢測指標(biāo)

2.6.1 大鼠行為觀察 每日上午10點(diǎn)觀察記錄各組大鼠的精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤度、體溫、食欲、糞便、飲水量、尿量、舌苔等。

2.6.2 大鼠采食量測量 在造模第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第15天、第16天和第17天分別測量各組大鼠的采食量。

2.6.3 大鼠飲水量測量 在造模第1天、第2天、第5天、第6天、第9天、第10天、第11天、第15天、第16天和第17天分別測量各組大鼠的飲水量。

2.6.4 大鼠體重測量 在造模前1天測量各組大鼠的空腹體重，并在造模第1天、第2天、第5天、第6天、第9天、第10天、第11天、第15天、第16天和第17天分別測量各組大鼠的體重。

2.6.5 大鼠尿量測量 在造模第1天、第2天、第5天、第6天、第9天、第10天、第11天、第15天、第16天和第17天分別測量各組大鼠的尿量。

2.6.6 大鼠體溫(肛周)測量 每天下午4點(diǎn)分別測量造模前1天和造模第1天、第2天、第5天、第6天、第9天、第10天、第11天、第15天各組大鼠的肛周溫度。在第16天和17天上午9點(diǎn)和下午4點(diǎn)各測一次肛溫。

2.6.7 大鼠腹瀉率和腹瀉指數(shù)測量 模型組大鼠在腹腔注射大腸桿菌或灌胃番瀉葉后每觀察腹瀉情況，并計算腹瀉率和腹瀉指數(shù)。

稀便率=每只動物的稀便次數(shù)/大便的總次數(shù)(稀便以濾紙上有無污跡為標(biāo)準(zhǔn))；

腹瀉指數(shù)=稀便率×稀便級。

稀便級別根據(jù)濾紙上污跡范圍的大小分為4級∶1級污跡直徑<1 cm；2級污跡直徑1.0～1.9 cm；3級污跡直徑2～3 cm；4級污跡直徑>3 cm。

3 結(jié)果分析

3.1 大鼠行為觀察

空白組大鼠一切行為正常。其它三組造模1～10 d內(nèi)各模型組大鼠表現(xiàn)活躍，被毛光澤，食欲旺盛，尿量增多，表現(xiàn)為舌苔黃膩，個別大鼠出現(xiàn)鼻口紅腫和出血癥狀。造模第11～15天各模型組大鼠出現(xiàn)體溫升高，嗜睡，呆滯癥狀。表現(xiàn)為大鼠被毛雜亂無光澤，食欲和飲欲都有不同程度的降低，鼻口紅腫和出血的大鼠比例明顯增多，并出現(xiàn)糞便黏滯。在造模第16～17 d，大鼠精神更差，多數(shù)大鼠蜷臥一團(tuán)，食欲和飲欲減少或廢絕，尿量減少，多數(shù)出現(xiàn)溏便和黏液便，個別大鼠有血便。

3.2 大鼠體重變化

圖1顯示在整個造模過程中空白組大鼠體重升高明顯，各模型組在高糖高脂階段均有升高的趨勢，但呈波浪式升高，可能與禁食有關(guān)，在高溫高濕階段，體重變化不明顯，略有降低；在灌胃番瀉葉和注射大腸桿菌后，這兩個模型組大鼠體重有明顯的下降，而高溫高濕模型組體重有明顯的上升。

圖1 各組大鼠體重變化趨勢折線圖(x±s)

3.3 大鼠采食量變化

圖2為各組大鼠采食量變化趨勢圖，造模前一天，各組大鼠禁食測量空腹體重，因此5.1日各組大鼠的采食量均有不同程度的升高，造模1～10 d內(nèi)各模型組采食量變化不大，但均低于空白組，可能因?yàn)榇笫蟾羧战?，脾胃損傷，導(dǎo)致采食量減少。高溫高濕階段各模型組大鼠采食量均有明顯的下降，尤其番瀉葉組和大腸桿菌組。

圖2 各組大鼠采食量變化趨勢折線圖(x±s)

3.4 大鼠飲水量變化

圖3各組大鼠飲水量變化趨勢圖，在高糖高脂階段各模型組飲水量是明顯升高的，呈波浪式升高，可能與禁食有關(guān)。在高溫高濕階段，飲水量急劇增加，可能與高溫有關(guān)，在注射大腸桿菌和灌服番瀉葉階段，飲水量幾乎呈現(xiàn)直線下降，尤其在5.16日以后比正常組均低，有可能是番瀉葉的損傷腸道和大腸桿菌的致病作用，導(dǎo)致飲水量比正常組低。

圖3 各組大鼠飲水量變化趨勢折線圖(x±s)

3.5 大鼠尿量變化

圖4各組大鼠尿量量變化趨勢圖，在高糖高脂階段各模型組尿量是明顯升高的，呈波浪式升高，可能與禁食有關(guān)。在高溫高濕階段，體內(nèi)水分散發(fā)較快，導(dǎo)致尿量減少，因此，可能與高溫有關(guān)。注射大腸桿菌和灌服番瀉葉，尿量減少，有可能是番瀉葉的瀉下作用導(dǎo)致大量的水分損失，和大腸桿菌致病是老鼠出現(xiàn)腹瀉而喪失水分，因此尿量比正常組低。

圖4 各組大鼠尿量變化趨勢折線圖(x±s)

3.6 大鼠體溫變化

圖5各組大鼠體溫變化趨勢圖，在高糖高脂階段，各模型組的體溫均比正常組略高，所以此階段無可比性。在高溫高濕階段，注射大腸桿菌和灌服番瀉葉后，體溫明顯上升，番瀉葉組將近比正常組高出0.5℃，大腸桿菌組比正常組高出1℃。可能是大腸桿菌造成了濕熱主癥。

圖5 各組大鼠體溫變化趨勢折線圖(x±s)

3.6 大鼠腹瀉率和腹瀉指數(shù)變化

大腸桿菌組在第一次注射大腸桿菌32 h后出現(xiàn)全部腹瀉，腹瀉率100%。番瀉葉組在第一次灌胃番瀉葉24 h后出現(xiàn)前部腹瀉，腹瀉率100%。

經(jīng)上述分析后得出結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)?zāi)艹晒駸嵝篂a模型，而且大腸桿菌組最符合中獸醫(yī)學(xué)臨床特點(diǎn)的大腸濕熱泄瀉模型。

4 討論

以生化學(xué)因素、癥狀、指標(biāo)、中藥復(fù)健治療為主要依據(jù)的大腸濕熱病證動物模型主要由外感暑濕、染疫癘之氣、飼喂霉敗穢濁或者有毒草料引發(fā)，以致?lián)p傷氣血而發(fā)病。

以飲食、氣候環(huán)境變化、大腸桿菌感染綜合因素所形成的濕熱泄瀉模型比較理想，尤其是濕熱證造模和大腸濕熱模型。等研究。本人在前人的基礎(chǔ)上，改良造模的方法，形成腹腔注射大腸桿菌配合飲食加環(huán)境復(fù)合法，復(fù)制大鼠大腸濕熱泄瀉模型，簡單易行、造模時間短、成功率高、重復(fù)性好，自愈時間長，并選取了行為學(xué)觀察，采食量、飲水量、尿量、體重、體溫、腹瀉率和腹瀉指數(shù)的變化說明模型的可靠性。結(jié)果表明，各模型組與空白組比較進(jìn)入高溫高濕階段從行為學(xué)觀察各模型組大鼠雖然出現(xiàn)發(fā)熱，嗜睡，呆滯癥狀。表現(xiàn)為大鼠被毛雜亂無光澤，食欲和飲欲都有不同程度的降低，鼻口紅腫和出血的大鼠比例明顯增多，并出現(xiàn)少量糞便粘滯。說明高溫高濕不是引起大腸濕熱證的主要原因。注射大腸桿菌和灌服番瀉葉后大鼠精神更差，多數(shù)大鼠蜷臥一團(tuán)，食欲和飲欲減少或廢絕，尿量減少，多數(shù)出現(xiàn)溏便和粘液便，個別大鼠有血便。此外大鼠體重降低，采食量均有明顯的下降，飲水量幾乎呈現(xiàn)直線下降，尤其在灌服番瀉葉和注射大腸桿菌以后比正常組均低，尿量呈現(xiàn)下降趨勢均比正常組低，體溫(大腸桿菌組)急劇上升，將近高達(dá)39℃。在從表1和表2中看出番瀉葉組在24 h內(nèi)腹瀉率達(dá)到100%，大腸桿菌組在32 h內(nèi)腹瀉率達(dá)到100%，且腹瀉指數(shù)與空白組比較都有有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此大腸桿菌組是最符合濕熱模型。由此證明本實(shí)驗(yàn)改良的造模方法是科學(xué)合理的。但是，本實(shí)驗(yàn)還存在許多不足之處，光憑臨床癥狀及其一些體征變化及腹瀉率和腹瀉指數(shù)不一定判定為大腸濕熱證，有時會混合感染其他疾病，應(yīng)該還從腸道的病理變化做組織切片檢查，還應(yīng)該進(jìn)一步檢測生化指標(biāo)、免疫因子、血常規(guī)等。

表1 各組所致濕熱腹瀉大鼠腹瀉指數(shù)的情況(x±s)

表2 各組所致濕熱腹瀉大鼠腹瀉指數(shù)的情況(x±s)