陳秀秀，孫洪浩，孫小涵，呂福軍

(遼寧波爾萊特農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司，遼寧 沈陽 110000)

隨著2019年禁抗令的頒布，飼料市場引起軒然大波，在動(dòng)物疫病錯(cuò)綜復(fù)雜，尤其是非洲豬瘟常態(tài)化的背景下，如何平穩(wěn)地過渡到“無抗時(shí)代”，已成為畜牧全行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)與挑戰(zhàn)。以生物技術(shù)為主導(dǎo)的畜牧生物產(chǎn)業(yè)正加速形成，并推動(dòng)畜牧業(yè)高效快速的發(fā)展。微生物飼料添加劑被認(rèn)為是抗生素的潛力替代物之一，具備改善生長性能、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和平衡腸道微生物菌群等作用。乳酸菌作為益生菌株應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖歷史悠久，其中應(yīng)用較多的為嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌和雙岐桿菌等。酵母菌類因其可以產(chǎn)香的特點(diǎn)進(jìn)而增加適口性，但此類制劑抗逆能力差，活菌存活率低，影響其飼喂效果。芽孢桿菌類益生菌因芽孢抗逆性強(qiáng)，可以直接添加至配合飼料中。因此，開發(fā)抗逆性強(qiáng)且對動(dòng)物健康有益的菌種成為全國高度關(guān)注的重大課題。

凝結(jié)芽孢桿菌( Bacillus coagulans )為革蘭氏陽性兼性厭氧菌，非致病菌，產(chǎn)芽孢產(chǎn)乳酸的桿菌，端生芽孢，能夠分解葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇等多種糖類產(chǎn)生L-乳酸，為同型乳酸發(fā)酵菌，最適生長溫度為40～50 ℃，最適生長pH 為6.6～7.0。凝結(jié)芽孢桿菌除具備普通乳酸菌的調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)代謝和提高免疫力的作用外，還具有耐膽鹽、耐胃腸消化液、熱穩(wěn)定性等生物特性。本研究對5個(gè)凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品的抑菌性、耐消化液能力、耐膽鹽能力和熱穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)，旨在為其飼料生產(chǎn)實(shí)踐篩選優(yōu)良產(chǎn)品，為凝結(jié)芽孢桿菌作為飼用添加劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

凝結(jié)芽孢桿菌均購自國內(nèi)不同廠家，分別命名為A、B、C、D、E；金黃色葡萄球菌(SA)、大腸埃希氏菌(K88)由本實(shí)驗(yàn)室保存；MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；生化鑒定所用試劑購自青島海博生物科技有限公司；人工胃液和人工腸液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌株分離鑒定

精確稱量1.000 g待測菌粉，置于100 mL稀釋液中， 37 ℃ 200 r/min充分振蕩30 min，； 80 ℃水浴20 min，梯度稀釋，MRS培養(yǎng)基傾注平板37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落進(jìn)行3次平板劃線純化菌株。

1.3 菌株生化鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 取疑似單菌落進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色，觀察細(xì)菌形態(tài)及芽孢形成狀態(tài)。

1.3.2 生化鑒定 根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌鑒定手冊》，對5株菌進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、55 ℃生長、7%氯化鈉生長、檸檬酸鹽利用、V-P試驗(yàn)、明膠液化、硝酸鹽還原、酪氨酸水解、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇發(fā)酵和溶菌酶生長等生化試驗(yàn)。

1.4 總菌數(shù)測定

精確稱量1.0 g待測菌粉，置于100 mL稀釋液中， 37 ℃ 200 r/min振蕩30 min；再10倍逐級稀釋至所需稀釋度，MRS培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.5 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

取4個(gè)重復(fù)中的2個(gè)1 mL 10-2菌粉稀釋液作為實(shí)驗(yàn)組，65 ℃、85 ℃、100 ℃水浴30 min，另外2個(gè)作為對照組不做處理。MRS培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，選取菌落數(shù)在30-300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，對照組不做處理，存活率計(jì)算公式如下：

存活率(%)=熱處理活菌數(shù)/對照組活菌數(shù)×100%

1.6 抑菌性試驗(yàn)

精確稱量0.003 g(按30 g/t添加量)待測菌粉，置于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中， 37 ℃ 200 r/min充分振蕩48 h，12 000 r/min離心5 min，取上清液用0.45 μm濾膜過濾備用。取活化后的指示菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌適量于LB液體培養(yǎng)基中，調(diào)整其吸光值約為0.05，測定600 nm處吸光度。實(shí)驗(yàn)組為4 mL指示菌液加1 mL實(shí)驗(yàn)菌液，對照組為4 mL指示菌液加1 mL生理鹽水。37 ℃ 200 r/min充分振蕩共培養(yǎng)3 h，測定600 nm處吸光度值，計(jì)算抑菌率。

抑菌率(%)=[(A空-A空0)-(A樣-A樣0)]/(A空-A空0)×100%

1.7 人工胃腸液耐受性試驗(yàn)

精確稱量1.0 g待測菌粉加入pH 2.0人工胃液，37 ℃靜置培養(yǎng)4 h后，MRS培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)。精確稱量1.000 g待測菌粉加入pH 7.6人工結(jié)腸液，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后，MRS培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)，對照組為生理鹽水。

存活率(%)=胃腸液處理活菌數(shù)/對照組活菌數(shù)×100%

1.8 耐膽鹽試驗(yàn)

取1 mL 10-2菌粉稀釋液，加入9 mL含有0.03%、0.1%、0.3%、0.5%、1%膽鹽濃度的MRS肉湯培養(yǎng)液中，對照組不做處理，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后， MRS培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)， 37 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，選取菌落數(shù)在30-300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

存活率(%)=膽鹽組處理活菌數(shù)/對照組活菌數(shù)×100%

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，參數(shù)組間比較采用 t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株形態(tài)

A、D、E菌落為白色，呈圓形且邊緣整齊；B菌落灰白色，圓形，邊緣不整齊、中心突起且有光澤； C菌落扁平，呈白色，圓形，邊緣整齊且中心無凸起。5個(gè)菌株均為革蘭氏陽性，菌體呈桿狀，芽孢端生，單個(gè)或成對，少數(shù)呈短鏈狀。

2.2 生理生化鑒定

由表1可知，菌株明膠液化陰性，V-P反應(yīng)為陽性，55 ℃ 生長為陽性，吲哚試驗(yàn)為陰性，7% 氯化鈉生長為陽性，溶菌酶生長為陰性，其他結(jié)果詳見表1。上述結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌鑒定手冊》中關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌的分析進(jìn)行比較，初步鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌。

表1 各菌株生理生化特征

2.3 總菌數(shù)測定結(jié)果

為了考察不同廠家的凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品的菌量與所標(biāo)注的是否一致，評價(jià)了5株凝結(jié)芽孢桿菌的總菌數(shù)，結(jié)果見表2。由表2可知，A、B、D、E的菌量均超出目標(biāo)菌量，符合標(biāo)準(zhǔn)，而C的實(shí)際菌量比目標(biāo)菌量少50億，E的實(shí)際菌量比目標(biāo)菌量大約少一個(gè)數(shù)量級。

表2 各菌株的目標(biāo)菌數(shù)測定

2.4 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

飼料生產(chǎn)過程中的某些環(huán)節(jié)如熱處理、制粒和膨化環(huán)節(jié)均需要高溫處理，溫度范圍一般在65～120 ℃之間，因此選擇65 ℃、85 ℃、100 ℃作為試驗(yàn)溫度處理30 min，研究高溫對5株凝結(jié)芽孢桿菌存活率的影響。由圖1 可知，5株均完全耐受65 ℃，存活率均在100%左右；85 ℃處理后僅A株可達(dá)到100%，其余4株菌均有所下降；至100 ℃水浴30 min后，A株仍可達(dá)62%，具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖1 不同溫度對凝結(jié)芽孢桿菌存活率的影響

2.5 抑菌性

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，比較5株凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌活性，篩選出效果優(yōu)的產(chǎn)品應(yīng)用于臨床生產(chǎn)。根據(jù)表3結(jié)果顯示，A株對共培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制活性優(yōu)于其他菌株，抑菌率分別是101.4%和99.8%，抑制大腸桿菌活性顯著高于B株(P<0.05)和E株(P<0.05)，同時(shí)也顯著高于D株(P<0.01)，抑制金黃色葡萄球菌活性顯著高于B株(P<0.05)和D株(P<0.05)，同時(shí)也顯著高于E株(P<0.01)。

表3 各菌株對指示菌的抑菌活性

同列無字母或數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，P<0.05和P<0.01是與A組相比。

2.6 人工胃腸液耐受性試驗(yàn)

通常豬的胃酸pH值在2.0-3.0，進(jìn)食后由于食物的中和作用pH可達(dá)5.0以上，流體食物在胃中停留時(shí)間為1-2 h，隨后進(jìn)入小腸中，因此對人工胃腸液耐受性決定了益生菌在胃腸道中所能發(fā)揮的益生作用。根據(jù)表3的結(jié)果可知，A和C有較好的胃酸耐受性，在pH2.0的強(qiáng)酸條件下，存活率仍在50%以上。A株完全耐受人工腸液，存活率為100%，優(yōu)于其他組凝結(jié)芽孢桿菌，其次是B株，存活率為95%。

2.7 耐膽鹽試驗(yàn)

豬小腸正常膽鹽濃度范圍是0.03%～0.3%，選擇0.03%、0.10%、0.30%、0.50%和1.00%5個(gè)膽鹽濃度，比較不同凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品的耐膽鹽能力。圖2結(jié)果表明，A株和B株最大耐受膽鹽濃度為1%，存活率可達(dá)100%以上，在小腸環(huán)境中可以正常生長；其余三組都受到膽鹽的抑制作用，膽鹽濃度達(dá)到0.50%時(shí)，存活率明顯下降約20%～30%。

表4 人工胃腸液對凝結(jié)芽孢桿菌存活率的影響

圖2 不同膽鹽濃度對凝結(jié)芽孢桿菌存活率的影響

3 討論

凝結(jié)芽孢桿菌作為可以形成芽孢的益生乳酸菌，既具有芽孢桿菌的特點(diǎn)，同時(shí)還具有乳酸菌的優(yōu)勢。研究表明凝結(jié)芽孢桿菌具有多種生物特性，例如抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善機(jī)體免疫功能、促進(jìn)消化吸收和改善仔豬腹瀉等。Sudha 等證實(shí)凝結(jié)芽孢桿菌IS2可以抑制炎癥因子IL-12、TN-α 和IFN-γ的表達(dá)，還能抑制環(huán)氧化酶COX-2的生成，從而抑制NF-κB P65 蛋白(Rel A)的表達(dá)。大量研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌在腸道內(nèi)生長代謝會分泌多種有益物質(zhì)，如脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、木聚糖酶、凝固素和Lactosporin等，這些酶類可以降解蛋白質(zhì)、淀粉等大分子，增強(qiáng)腸道代謝率，進(jìn)而提高飼料的利用率；多肽類抑菌物質(zhì)凝固素是由 44 個(gè)氨基酸組成，呈現(xiàn)為一個(gè)α-螺旋連接兩個(gè)無規(guī)則卷曲的線性結(jié)構(gòu)，能不受細(xì)胞膜限制而自由穿越，且不受淀粉酶、脂酶和有機(jī)溶劑的影響。細(xì)菌素Lactosporin可穿透致病菌表面，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氨基酸、無機(jī)鹽離子泄露，從而起到抑制病原菌的作用 。

凝結(jié)芽孢桿菌作為益生菌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，除具有以上生物特性外，還具有耐熱和耐膽鹽等高抗逆性。本研究比較5個(gè)不同廠家的凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品的一些生理特性，通過對5株凝結(jié)芽孢桿菌的研究，結(jié)果顯示A和B菌株具有較好的高溫耐受性，在85 ℃條件下作用30 min，存活率可達(dá)到90%以上；菌種對細(xì)菌具備一定的抑菌能力，抑菌活性從高到低排序依次為A、C、D、E、B；A和C菌株具有較好的酸耐受性，用pH2.0人工胃液處理4 h，菌種存活率能達(dá)到50.0% 以上；5個(gè)菌株均可以耐受0.3%膽鹽，可以在小腸環(huán)境中正常生長。因此，可選擇抗逆性能最好的A株凝結(jié)芽孢桿菌作為備選飼料添加劑。隨著對凝結(jié)芽孢桿菌的進(jìn)一步研究，凝結(jié)芽孢桿菌因其自身的特點(diǎn)和優(yōu)勢，在飼料微生態(tài)制劑中發(fā)展應(yīng)用潛力巨大，前景廣闊。今后將對凝結(jié)芽孢桿菌的益生性能做進(jìn)一步的研究。