黃靜,姜宏,劉穎,劉迎春,倪豐
(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○一醫(yī)院生殖中心,合肥 230031)
人類輔助生殖技術(shù)(ART)是不孕癥治療的重要手段之一,在全球范圍內(nèi)的臨床應(yīng)用不斷增加。胚胎質(zhì)量是影響體外受精(IVF)結(jié)局的重要影響因素。傳統(tǒng)的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估因其快速簡單、對(duì)胚胎無創(chuàng)等特點(diǎn)是目前最常用的胚胎評(píng)估方法。然而,該法依賴于觀察者的經(jīng)驗(yàn)和水平,評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)主觀,需多次在培養(yǎng)箱以外的環(huán)境中對(duì)胚胎進(jìn)行觀察,且并不能完全準(zhǔn)確預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能和種植能力[1-3]。
近年,隨著各種組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,新的非侵入性胚胎評(píng)估策略受到眾多學(xué)者的關(guān)注。其中,代謝組學(xué)是關(guān)于生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)種類、數(shù)量及變化規(guī)律的科學(xué),是研究生物整體、系統(tǒng)、器官或細(xì)胞的內(nèi)源性代謝物質(zhì)及內(nèi)在或外在因素相互作用的科學(xué)[4],其研究的目標(biāo)為細(xì)胞活動(dòng)過程的最終產(chǎn)物,更接近生物的功能表型,可提供較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)更多的信息。
拉曼光譜作為代謝組學(xué)最常用的分析技術(shù)之一,是在印度物理學(xué)家拉曼發(fā)現(xiàn)的拉曼散射效應(yīng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,研究分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)信息的一種光譜技術(shù)[5],而分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)信息能夠反映其結(jié)構(gòu)特征,即每一種物質(zhì)都有其各自特征的拉曼光譜。因此,通過檢測樣品的拉曼散射并繪制成光譜,分析拉曼光譜的峰位信息便可以鑒定樣品,并推導(dǎo)出有關(guān)樣品的結(jié)構(gòu)和化學(xué)等相關(guān)信息[6]。由于拉曼光譜具有非侵入、檢測迅速、信息豐富、敏感度高、無需樣本制備等優(yōu)點(diǎn),更重要的是受水的干擾小,特別適用于IVF領(lǐng)域胚胎培養(yǎng)液代謝組學(xué)的檢測。本研究通過拉曼光譜結(jié)合傳統(tǒng)的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法中的主成分分析(PCA)和先進(jìn)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法對(duì)優(yōu)質(zhì)胚胎和非優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行分析,以期在傳統(tǒng)的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估基礎(chǔ)上,尋找快速、無創(chuàng)以及更客觀可靠的胚胎質(zhì)量評(píng)估方法,為選擇性單胚胎移植提供具有最佳發(fā)育潛能的胚胎。
收集2018年5月至2019年1月在我院生殖中心行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)治療患者的D3胚胎培養(yǎng)液。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)女方年齡<38歲;(2)促排卵方案為拮抗劑方案;(3)受精方式為ICSI。排除女方多囊卵巢綜合征、男方無精子癥、夫妻雙方染色體異常或有嚴(yán)重的全身代謝性或免疫性疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審議批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書。
本研究共納入16例患者的D3胚胎培養(yǎng)液共122份。根據(jù)D3胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分,將其對(duì)應(yīng)的胚胎培養(yǎng)液分為優(yōu)質(zhì)胚胎組(66份)和非優(yōu)質(zhì)胚胎組(56份),另選擇無胚胎的D3胚胎培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組(20份)用于拉曼光譜測定的均一化預(yù)處理。
1.控制性促排卵(COS):所有患者均采用促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-ant)靈活方案進(jìn)行COS。根據(jù)患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)性激素、竇卵泡數(shù)及抗苗勒管激素(AMH)水平于月經(jīng)周期第2或第3天給予100~300 U的促卵泡生長激素(FSH)(果納芬,默克雪蘭諾,瑞士)皮下注射或肌肉注射,根據(jù)陰道超聲和性激素水平監(jiān)測卵泡生長并調(diào)整用藥量,當(dāng)最大卵泡≥12~14 mm或E2>1 100 pmol/L,予GnRH-ant(醋酸西曲瑞克,思則凱,默克雪蘭諾,瑞士)0.25 mg/d皮下注射。當(dāng)1個(gè)主導(dǎo)卵泡≥18 mm或3個(gè)以上主導(dǎo)卵泡≥17 mm時(shí),予重組人絨毛膜促性腺激素(rHCG,艾澤,默克雪蘭諾,瑞士)250 μg皮下注射,36 h后行經(jīng)陰道超聲取卵術(shù)。將所獲的卵冠丘復(fù)合物放入預(yù)平衡的G-IVF培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)中,置入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。
2.ICSI:采用透明質(zhì)酸酶80 U/ml(hyaluronidase,SAGE,美國)消化卵冠丘復(fù)合物,毛細(xì)管輕柔去除包繞卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞后,將卵母細(xì)胞置入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中待用。選擇具有第一極體的成熟卵母細(xì)胞置入ICSI皿中,7%聚乙烯吡咯烷酮(PVP,SAGE,美國)微滴中精子制動(dòng),并注入卵胞漿內(nèi),注射后的卵母細(xì)胞移入G-1 plus培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)中繼續(xù)培養(yǎng)。
3.受精及胚胎評(píng)分:ICSI后16~18 h觀察受精情況,出現(xiàn)2原核(PN)認(rèn)為是正常受精,將正常受精單個(gè)胚胎置于G-1 plus培養(yǎng)液中培養(yǎng),受精后D3由同一名實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)胚胎進(jìn)行觀察和評(píng)分,以確保一致性。
胚胎形態(tài)評(píng)分:D3胚胎評(píng)估參數(shù)主要有卵裂球的數(shù)量、大小、形狀、對(duì)稱性、胞質(zhì)的形態(tài)、有無碎片和空泡等。參照既往文獻(xiàn)[7],將胚胎分為4個(gè)等級(jí):I級(jí)(優(yōu)質(zhì))胚胎:卵裂球大小均勻,形狀規(guī)則,透明帶完整,胞質(zhì)均勻無顆?,F(xiàn)象,碎片極少(碎片≤5%);Ⅱ級(jí)胚胎:卵裂球大小稍不均勻,形狀稍不規(guī)則,胞質(zhì)有顆?,F(xiàn)象,碎片比例6%~20%;Ⅲ級(jí)胚胎:卵裂球不均勻,形狀不規(guī)則,胞質(zhì)有明顯顆粒現(xiàn)象,碎片比例20%~50%;Ⅳ級(jí):卵裂球嚴(yán)重不均勻,形狀嚴(yán)重不規(guī)則,胞質(zhì)有嚴(yán)重顆?,F(xiàn)象,碎片>50%。D3卵裂球數(shù)目7~10個(gè)的Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎,D3卵裂球數(shù)目7~10個(gè)的Ⅲ級(jí)胚胎及卵裂球數(shù)5~6個(gè)的Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎定義為非優(yōu)質(zhì)胚胎。
4.樣本收集及保存:將優(yōu)質(zhì)胚胎組和非優(yōu)質(zhì)胚胎組的D3培養(yǎng)液,各吸取15~20 μl 轉(zhuǎn)入已標(biāo)記的Eppendorf管中,-80℃冰箱冷凍保存,待用。
5.拉曼光譜測定:冷凍胚胎培養(yǎng)液在25℃室溫下復(fù)溫30 min,吸取10 μl樣品置于BaseRaman拉曼分析儀(蘇州貝康醫(yī)療器械有限公司)自帶的顯微鏡下進(jìn)行拉曼光譜分析,激光器波長為785 nm,激光輸出功率300 mW,激光焦點(diǎn)100 μm,半導(dǎo)體制冷陣列CCD(-26℃),單次積分時(shí)間為20 s,取單個(gè)樣本3次重復(fù)測試的平均值作為最終結(jié)果。
6.數(shù)據(jù)處理與分析數(shù)據(jù):分析流程:(1)原始數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)化;(2)轉(zhuǎn)化后的數(shù)據(jù)預(yù)處理;(3)預(yù)處理數(shù)據(jù)PCA可視化;(4)使用機(jī)器學(xué)習(xí)構(gòu)建模型并評(píng)估。詳見圖1。
圖1 數(shù)據(jù)分析流程
具體方法如下:獲得培養(yǎng)液檢測數(shù)據(jù)后,需要對(duì)原始檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以得到標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)用于后續(xù)模型構(gòu)建及預(yù)測。首先提取300~2 000 cm-1范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)用于下一步的標(biāo)準(zhǔn)化處理;對(duì)上一步得到的數(shù)據(jù)采用向量均一化方法進(jìn)行數(shù)據(jù)均一化處理,并選擇600~1 800 cm-1范圍內(nèi)的數(shù)據(jù),以消除拉曼光譜整體信號(hào)強(qiáng)度差異造成的影響;然后分別使用Haar及Daubechies 4小波變換方法將處理后的拉曼信號(hào)進(jìn)行降噪處理,生成兩組變換后的拉曼信號(hào)。將小波變換后的兩組信號(hào)作為樣本的兩個(gè)特征向量,構(gòu)建后續(xù)預(yù)測模型所使用的輸入數(shù)據(jù)。最后使用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(CNN)算法對(duì)所有樣本的拉曼數(shù)據(jù)進(jìn)行模型構(gòu)建及結(jié)果預(yù)測。CNN模型包括512個(gè)卷積核心,以relu為激活函數(shù),其預(yù)測主要指標(biāo)為:敏感性(Sensitity)、特異性(Specificity)和準(zhǔn)確度(Accurary)。真陽性數(shù)(True positives,TP)、真陰性數(shù)(True negatives,TN)、假陽性數(shù)(False positive,F(xiàn)P)、假陰性數(shù)(False negative,F(xiàn)N),計(jì)算公式:敏感性=TP/(TP+TN);特異性=TP/(TP+FP);準(zhǔn)確度=(TP+TN)/(TP+FP+TN+FN)。
如圖2所示,優(yōu)質(zhì)胚胎組與非優(yōu)質(zhì)胚胎組的PCA可視化結(jié)果部分?jǐn)?shù)據(jù)重疊,大部分?jǐn)?shù)據(jù)可見明顯的聚類,優(yōu)質(zhì)胚胎組與非優(yōu)質(zhì)胚胎組的拉曼光譜明顯不同。
PCA計(jì)算的loadings結(jié)果顯示,優(yōu)質(zhì)胚胎組與非優(yōu)質(zhì)胚胎組間第一維主成分(PC1)存在顯著性差異(P<0.05),第二維主成分(PC2)和第三維主成分(PC3)無顯著性差異(P>0.05),表明優(yōu)質(zhì)胚胎組與非優(yōu)質(zhì)胚胎組的拉曼光譜有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。通過對(duì)PCA的loadings分析,發(fā)現(xiàn)差異主要由第一維主成分的1 050~1 150 cm-1、1 250~1 350 cm-1和1 400~1 500 cm-1三個(gè)拉曼位移區(qū)段貢獻(xiàn)(圖3)。
A:二維PCA,黃色表示優(yōu)質(zhì)胚胎樣本,藍(lán)色表示非優(yōu)質(zhì)胚胎樣本;B:三維PCA,藍(lán)色表示優(yōu)質(zhì)胚胎樣本,紅色表示非優(yōu)質(zhì)胚胎樣本圖2 二維及三維PCA結(jié)果
紅色表示非優(yōu)質(zhì)胚胎組,藍(lán)色表示優(yōu)質(zhì)胚胎組。與優(yōu)質(zhì)組比較,*P<0.05圖3 PCA聚類分析與載荷向量
采用機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建模型,拉曼光譜預(yù)測優(yōu)質(zhì)胚胎的特異性為71.21%,敏感性為73.21%,準(zhǔn)確性為72.13%。具體檢測情況見表1。
表1 CNN模型預(yù)測胚胎質(zhì)量評(píng)估結(jié)果(n=122)
代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后興起的一個(gè)新的組學(xué)研究熱點(diǎn),是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。因其檢測技術(shù)多樣、操作簡單、信息豐富全面,已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐。
目前ART領(lǐng)域代謝組學(xué)的主要研究對(duì)象為卵母細(xì)胞、精子和胚胎,目標(biāo)代謝物主要為乳酸、丙酮酸、葡萄糖和氨基酸等。夏蘭等[8]應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對(duì)13例反復(fù)失敗IVF患者和15例首個(gè)周期成功妊娠患者的卵泡液代謝物進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)反復(fù)失敗組卵泡液中部分氨基酸含量顯著升高,二元羧酸、膽固醇及部分有機(jī)酸含量顯著降低。Gupta等[9]對(duì)125例不育男性和60例正常男性的精液樣本進(jìn)行核磁共振波譜(NMR)檢測,發(fā)現(xiàn)不育男性與正常男性的丙氨酸、檸檬酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量有顯著差異。另有研究顯示,胚胎的丙酮酸攝取范圍波動(dòng)較大,但在可種植胚胎,其波動(dòng)范圍縮小[10]。Brison等[11]使用高效液相色譜(HPLC)對(duì)培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)液中的氨基酸濃度進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)天冬氨酸、甘氨酸濃度的降低及亮氨酸濃度的升高與IVF妊娠結(jié)局相關(guān)。Seli等[12]采用質(zhì)子核磁共振(1HNMR)技術(shù)發(fā)現(xiàn)D3胚胎培養(yǎng)液中谷氨酸水平的升高與臨床妊娠和活產(chǎn)之間具有相關(guān)性,其預(yù)測種植胚胎的敏感性為88.2%,特異性為88.2%。上述研究結(jié)果均證實(shí),卵泡液、精液和胚胎培養(yǎng)液中代謝物的變化與人類卵母細(xì)胞、精子和胚胎的質(zhì)量及臨床結(jié)局密切相關(guān)。但單獨(dú)的代謝物變化較大,尚不能作為配子/胚胎質(zhì)量評(píng)估的可靠生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)可更全面、準(zhǔn)確地反映配子/胚胎細(xì)胞代謝過程的最終產(chǎn)物概況。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)卵泡液中部分代謝物與卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能有關(guān),并可預(yù)測IVF結(jié)局[13]。Vergouw等[14]進(jìn)一步證實(shí),采用近紅外光譜(NIR)分析胚胎培養(yǎng)液的代謝組學(xué)可以區(qū)分著床胚胎和未著床胚胎,并與冷凍周期單胚胎移植的活產(chǎn)率相關(guān)[15]。
培養(yǎng)液為胚胎體外生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)和代謝微環(huán)境,培養(yǎng)液中代謝物的變化可直接反應(yīng)胚胎發(fā)育和代謝狀態(tài),與胚胎質(zhì)量密切相關(guān),因此對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行代謝組學(xué)分析可作為一種無創(chuàng)、客觀的評(píng)估胚胎質(zhì)量的方法。在代謝組學(xué)的眾多分析技術(shù)中,拉曼光譜因具有非侵入、敏感度高、無需樣本制備及受水的干擾小等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于胚胎培養(yǎng)液的檢測。Seli等[16]利用拉曼光譜對(duì)已知妊娠結(jié)局的D3胚胎培養(yǎng)液進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)妊娠組與非妊娠組的硫氫鍵-SH、碳?xì)滏I-CH、氮?dú)滏I-NH存在差異,其敏感性為86%,特異性為76.5%,并在隨后的研究中,將預(yù)測陰性結(jié)果的特異性進(jìn)一步提高到80%[17]。董梅等[18]利用拉曼光譜檢測D3胚胎培養(yǎng)液,發(fā)現(xiàn)妊娠組丙酮酸/白蛋白比值顯著高于非妊娠組,并且聯(lián)合丙酮酸和形態(tài)學(xué)預(yù)測妊娠成功的敏感度為72%,特異度84%。Liang等[19]的近期研究發(fā)現(xiàn),胚胎培養(yǎng)液中的代謝組學(xué)與胚胎的染色體整倍性相關(guān),胚胎染色體異??蓪?dǎo)致培養(yǎng)液中代謝足跡的變化,并可通過拉曼光譜檢出,其中整倍體胚胎與非整倍體胚胎的差異位于967~1 015 cm-1、1 229~1 295 cm-1和1 400~1 430 cm-1三個(gè)拉曼位移區(qū)。Ding等[20]研究結(jié)果顯示,D3胚胎培養(yǎng)液的拉曼光譜與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評(píng)分結(jié)果一致,優(yōu)質(zhì)胚胎與非優(yōu)質(zhì)胚胎在拉曼位移峰值755 cm-1處有顯著差異。本研究的結(jié)果也證實(shí),優(yōu)質(zhì)胚胎組與非優(yōu)質(zhì)胚胎組的D3胚胎培養(yǎng)液具有不同的拉曼光譜,其預(yù)測敏感性為73.21%,特異性為71.21%,提示胚胎培養(yǎng)液的代謝組學(xué)與胚胎質(zhì)量相關(guān);但本研究差異主要由第一維主成分1 050~1 150 cm-1、1 250~1 350 cm-1和1 400~1 500 cm-1三個(gè)拉曼位移區(qū)段貢獻(xiàn),推測可能是由于本研究與上述研究所采用的培養(yǎng)液不同。培養(yǎng)液成分的不同導(dǎo)致代謝組學(xué)的特征光譜不同,查閱相關(guān)分子鍵產(chǎn)生拉曼峰的特性為:1 096 cm-1特征峰體現(xiàn)的是DNA分子中 PO2的伸展模式,1 300 cm-1、1 420 cm-1及1 463 cm-1特征峰體現(xiàn)的分別是脂類CH2扭轉(zhuǎn)、CH2振動(dòng)以及CH3/CH2變形模式[21-23]。
綜上所述,優(yōu)質(zhì)胚胎與非優(yōu)質(zhì)胚胎其拉曼光譜顯著不同,采用拉曼光譜結(jié)合PCA分析及CNN算法,可以區(qū)分優(yōu)質(zhì)胚胎與非優(yōu)質(zhì)胚胎,對(duì)胚胎質(zhì)量評(píng)估有一定的參考價(jià)值。但本研究預(yù)測特異性、敏感性和準(zhǔn)確度仍有待提高,推測可能與樣本量相關(guān)。