楊靜雅，張開遜，張東東，趙麗莉，賀學(xué)禮

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

藥用植物作為全球重要新藥來源，在醫(yī)療系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[1].近年來對(duì)藥用植物需求量迅速增加，野生藥用植物資源已不能滿足中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展需求，許多重要的藥用植物已經(jīng)通過人工栽培進(jìn)行生產(chǎn)[2-3]，但隨著農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境惡化，如全球氣候變化、降雨量減少、極端天氣條件等，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)方式受到嚴(yán)重影響[4-5].諸多因子中，干旱是影響其正常生長(zhǎng)、產(chǎn)量和質(zhì)量的最主要限制因素之一[6]，尋找安全高效的方法對(duì)提高中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義.研究表明，植物對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)與有益微生物密切相關(guān)[7].如叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)和根瘤菌可以幫助植物應(yīng)對(duì)土壤水分虧缺，直接或間接影響植物地上和地下功能，有效緩解干旱對(duì)其生長(zhǎng)的不利影響[8-9].除了菌根真菌、根瘤菌等，木霉菌作為自然界廣泛分布的植物促生真菌，能夠增強(qiáng)植物對(duì)生物和非生物脅迫(如干旱和鹽度)的耐受性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也扮演著重要角色[10-11].

木霉菌(Trichoderma)屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)、絲孢綱(Hyphomycetes)、叢梗孢目(Hyphomycetales)、叢梗孢科(Moniliaceae)，常見于土壤中，是土壤微生物群落的重要組成部分[12].Zohair等[1]從藥用植物根區(qū)土壤中分離出T.gamsii，將其接種到藥用植物羅勒(Ocimumbasilicum),結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種T.gamsii不僅顯著提高了羅勒生物量，還減少了病原菌的侵染.Amini等[13]從藥用植物紅棗根區(qū)土壤分離的木霉菌可減少病原菌對(duì)紅棗的傷害.研究表明木霉菌不僅對(duì)植物病原菌有拮抗作用，對(duì)植物生長(zhǎng)還具有促生作用[14].Mona等[15]發(fā)現(xiàn)T.harzianum能促進(jìn)番茄生長(zhǎng)，增強(qiáng)番茄對(duì)干旱脅迫的耐受性.Shukla等[16]研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌可降低干旱脅迫對(duì)水稻的影響，促進(jìn)水稻在干旱環(huán)境中生長(zhǎng).然而，不同木霉菌株生物學(xué)特性存在一定差異，對(duì)干旱脅迫的耐受能力不同[17-18].因此，深入研究木霉菌對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，對(duì)于篩選優(yōu)良菌種，促進(jìn)植物健康生長(zhǎng)具有重要意義.

國內(nèi)外對(duì)木霉菌自身耐旱性研究較少.王強(qiáng)強(qiáng)等[17]研究了5種木霉菌(哈茨木霉、棘孢木霉、深綠木霉、黃綠木霉和貴州木霉)對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)不同木霉菌對(duì)溫度、鹽以及干旱脅迫具有一定耐受性.尹大川等[18]研究干旱脅迫及NaCl脅迫對(duì)哈茨木霉菌生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)哈茨木霉T28具有較強(qiáng)耐旱和耐鹽能力.目前，關(guān)于藥用植物根區(qū)木霉菌對(duì)干旱脅迫耐受性研究鮮見報(bào)道.本研究以分離自河北安國中藥材種植基地藥用植物根區(qū)土壤的木霉菌為研究對(duì)象，通過PEG-6000模擬干旱脅迫，測(cè)定木霉菌菌落直徑、產(chǎn)孢量、生物量等生長(zhǎng)指標(biāo)，以及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、可溶性蛋白和超氧化物歧化酶(SOD)等生理指標(biāo)，探究木霉菌對(duì)干旱脅迫的耐受性，篩選抗旱能力強(qiáng)的木霉菌株.后續(xù)將篩選出的木霉菌接種至藥用植物，進(jìn)行不同干旱程度的室內(nèi)盆栽實(shí)驗(yàn)和田間實(shí)地試驗(yàn)；研究干旱脅迫下木霉菌對(duì)其生長(zhǎng)的影響，為進(jìn)一步發(fā)掘抗旱促生優(yōu)良菌種資源、開發(fā)木霉菌劑提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用菌株分離自河北安國中藥材種植基地藥用植物根區(qū)土壤，菌種保藏于河北大學(xué)菌根生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室.

1.2 木霉菌 rDNA ITS測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用真菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司提供)，所用引物、擴(kuò)增體系、反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[19].將測(cè)序所得序列在GenBank中BLAST比對(duì)，利用MEGA 6.0以Maximum Likelihood方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 固體培養(yǎng)

通過PEG-6000模擬不同程度干旱脅迫，在PDA培養(yǎng)基中分別添加60、120、180、240 g/L的PEG-6000.在無菌條件下，用10 mm無菌打孔器從培養(yǎng)7 d的PDA培養(yǎng)基菌落邊緣分別取供試木霉菌菌餅，將其置于含不同質(zhì)量濃度PEG-6000的PDA培養(yǎng)基中央，以不加PEG-6000的培養(yǎng)基為對(duì)照組，共5個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)，將其放置培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d.第3天用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，第4天測(cè)定產(chǎn)孢量.

1.3.2 液體培養(yǎng)

通過在YM液體培養(yǎng)基[20]中分別添加60、120、180、240 g/L的PEG-6000模擬不同程度干旱脅迫.在無菌條件下，用10 mm無菌打孔器從培養(yǎng)7 d的PDA培養(yǎng)基菌落邊緣分別取供試木霉菌菌餅，將其餅接種到含有150 mL YM液體培養(yǎng)基的錐形瓶(250 mL)中，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù).將錐形瓶置于恒溫?fù)u床中，在28 ℃，130 r/min條件下培養(yǎng)7 d.第7天使用真空泵將菌絲抽濾到濾紙，用蒸餾水清洗并收集菌絲體.將新鮮菌絲隨機(jī)分為2部分，一部分用于SOD活性、MDA、GSH和可溶性蛋白含量測(cè)定，其余菌絲體稱重后，置于烘箱80 ℃烘至恒重，稱量菌絲干重.木霉菌總生物量即這2部分菌絲體干重之和.

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑；血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算產(chǎn)孢量[21]；氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[22]測(cè)定SOD活性；硫代巴比妥酸法[22]測(cè)定MDA含量；二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)法[22]測(cè)定GSH含量；考馬斯亮藍(lán)G-250法[22]測(cè)定可溶性蛋白含量.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2010整理數(shù)據(jù)，SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和雙因素方差分析(two-way ANOVA).Canoco 4.5 軟件進(jìn)行主成分分析.

2 結(jié)果分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)鑒定

如圖1所示，T1菌落生長(zhǎng)快速，在PDA上25 ℃培養(yǎng)72 h，菌落直徑可達(dá)9 cm；培養(yǎng)初期無色素產(chǎn)生，培養(yǎng)7 d后出現(xiàn)橘黃色色素.產(chǎn)孢較晚，產(chǎn)孢區(qū)呈黃綠色；分生孢子豐富，孢子呈亞球狀，淺綠色，與楊合同[23]對(duì)T.afroharzianum形態(tài)學(xué)描述相符.T2菌落生長(zhǎng)快速，在PDA上25 ℃培養(yǎng)72 h，菌落直徑可達(dá)7.6 cm；培養(yǎng)96 h，菌落邊界清晰，中央有相對(duì)致密的圓盤狀結(jié)構(gòu)，是分生孢子主要產(chǎn)生區(qū)域；氣生菌絲多，無成堆產(chǎn)孢簇.分生孢子梗為單側(cè)分支，也見對(duì)生分支，孢子呈球形，與楊合同[23]對(duì)T.atroviride形態(tài)學(xué)描述相一致.T3在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，菌絲呈白色，后期產(chǎn)生絮狀氣生菌絲；孢子呈球狀或近球狀，與Katoch等[24]對(duì)T.lixii形態(tài)學(xué)描述相一致.T4生長(zhǎng)快速，培養(yǎng)48 h內(nèi)開始產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量大，產(chǎn)孢區(qū)呈同心輪紋排列，分生孢子堆呈黑綠色，有白色雜斑點(diǎn)；菌絲呈淡綠色，孢子呈暗綠色，橢圓形，表面光滑，與楊合同[23]對(duì)T.longibrachiatum形態(tài)學(xué)描述相符.T5菌落具有明顯同心環(huán)狀結(jié)構(gòu)；菌落邊緣不規(guī)則，菌落中央不育，周圍是大量分生孢子形成的同心輪紋；產(chǎn)孢區(qū)綠色，孢子近球形、綠色，與楊合同[23]對(duì)T.brevicompactum形態(tài)學(xué)描述相一致.T6菌落圓形，有大量氣生菌絲，表面疏松，白色至黃色，具有粉末狀物質(zhì)，不產(chǎn)生擴(kuò)散色素.分生孢子梗對(duì)生，孢子呈橢圓形，與Jaklitsch等[25]對(duì)T.virilente形態(tài)學(xué)描述相符.T7在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，開始菌落呈無色，后期呈綠色，幾乎占據(jù)整個(gè)培養(yǎng)皿.菌絲無色，多分枝，分枝頂端形成分生孢子團(tuán)；分生孢子團(tuán)不明顯，分生孢子呈球形，與Kunanbayev等[26]對(duì)T.inhamatum形態(tài)學(xué)描述相一致.

T1-T7.不同木霉菌種；a-g.不同木霉菌菌絲(Hy)；a1-g1.不同木霉菌分生孢子(Co).圖1 木霉菌落、菌絲和分生孢子形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of colony,hypha and conidia of Trichoderma spp.

將測(cè)序所得序列在GenBank中BLAST比對(duì)，利用MEGA 6.0以Maximum Likelihood方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)，加入了Trichodermasp.、Herpotrichiasp.和Paraconiothyriumsp.作為外群，代表種分別為T.taxi(NR_134366.1)、T.lanuginosum(NR_134429.1)和T.lanuginosum(MH863649.1)以及Herpotrichiastriatispora(NR_160103.1)、H.striatispora(MH858624.1)和Paraconiothyriumbrasiliense(NR_163552.1).結(jié)合菌落形態(tài)、顯微特征和DNA分子鑒定，T1、T2、T3、T4、T5、T6和T7分別被鑒定為T.afroharzianum、T.atroviride、T.lixii、T.longibrachiatum、T.brevicompactum、T.virilente和T.inhamatum(圖2).

圖2 基于真菌 rDNA ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree generated by the maximum likelihood method based on their rDNA ITS sequence of fungi

2.2 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對(duì)木霉菌生長(zhǎng)的影響

由表1和圖3可知，除T.lixii外，其他菌種菌落直徑低于對(duì)照組.對(duì)于T.lixii，在PEG-6000質(zhì)量濃度60 g/L和120 g/L時(shí)，木霉菌菌落直徑分別為5.93、5.87 cm，均高于對(duì)照組，干旱脅迫未表現(xiàn)出對(duì)其菌落直徑的抑制作用.T.brevicompactum和T.virilente菌落直徑隨脅迫程度加劇而不斷降低，較對(duì)照組差異顯著.在正常水分下，T.afroharzianum和T.longibrachiatum菌落直徑分別為8.80、8.70 cm；在PEG-6000質(zhì)量濃度180 g/L時(shí)，其菌落直徑分別為7.57、7.43 cm.而T.inhamatum在正常水分下菌落直徑為4.70 cm；在PEG-6000質(zhì)量濃度240 g/L時(shí)，其菌落直徑為2.47 cm，顯著低于對(duì)照組47.75%.不同干旱處理，木霉菌表現(xiàn)出不同生長(zhǎng)特性，其對(duì)干旱脅迫的耐受性也不同.

表1 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理下木霉菌菌落直徑Tab.1 Colony diameter of Trichoderma spp.with different PEG-6000 mass concentrations

A-G.不同木霉菌種：依次為T.afroharzianum、T. atroviride、T. lixii、T. longibrachiatum、T.brevicompactum、T. virilente、T. inhamatum；1-5.不同PEG-6000質(zhì)量濃度(0、60、120、180、240 g/L)處理.圖3 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理下木霉菌菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of Trichoderma spp.with different PEG-6000 mass concentrations

2.3 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對(duì)木霉菌產(chǎn)孢量的影響

由圖4可知，干旱脅迫下不同木霉菌產(chǎn)孢量不同，且同一木霉菌在不同干旱程度下，產(chǎn)孢量存在差異.正常水分和不同干旱程度下，T.longibrachiatum和T.afroharzianum產(chǎn)孢量顯著高于其他木霉菌.隨干旱程度增強(qiáng)，除T.atroviride、T.lixii和T.longibrachiatum外，其他木霉菌產(chǎn)孢量整體呈下降趨勢(shì)；且PEG-6000質(zhì)量濃度240 g/L時(shí)，所有木霉菌產(chǎn)孢量均顯著低于對(duì)照組.T.longibrachiatum在PEG-6000質(zhì)量濃度180 g/L時(shí)，與其他木霉菌相比，產(chǎn)孢量最大，為2.45×108cfu/mL，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而T.lixii產(chǎn)孢量隨干旱程度增強(qiáng)先升后降，PEG-6000質(zhì)量濃度60 g/L時(shí)，產(chǎn)孢量(5.25×107cfu/mL)最大，且不同處理之間存在顯著差異.PEG-6000質(zhì)量濃度高于60 g/L時(shí)，除T.longibrachiatum外，其他菌種產(chǎn)孢量低于對(duì)照組，產(chǎn)孢受到不同程度抑制.

不同小寫字母表示不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理下木霉菌產(chǎn)孢量存在顯著性差異(P<0.05).圖4 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對(duì)木霉菌產(chǎn)孢量的影響Fig.4 Effect of different PEG-6000 mass concentrations on sporulation quantity of Trichoderma spp.

2.4 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對(duì)木霉菌生物量的影響

由圖5可知，隨干旱程度增強(qiáng)，T.atroviride、T.lixii、T.virilente和T.longibrachiatum生物量先升后降，4種木霉生物量最高分別為0.227、0.332、0.236和0.338 g.T.longibrachiatum和T.brevicompactum在PEG-6000質(zhì)量濃度120 g/L時(shí)生物量略低于對(duì)照組，其他干旱程度下生物量均高于對(duì)照組；其中PEG-6000質(zhì)量濃度240 g/L時(shí)T.longibrachiatum生物量最大，為0.338 g，較對(duì)照組顯著增加了79.93%；而T.brevicompactum在PEG-6000質(zhì)量濃度180 g/L時(shí)生物量最大，為0.289 g，較對(duì)照組顯著增加了26.20%.干旱脅迫未表現(xiàn)出對(duì)其生物量的抑制作用，說明T.longibrachiatum和T.brevicompactum抗旱效果明顯.對(duì)于T.inhamatum，僅在PEG-6000質(zhì)量濃度120 g/L時(shí)，生物量(0.184 g)稍高于對(duì)照組，其他PEG-6000質(zhì)量濃度下生物量均低于對(duì)照組，說明其抗旱力較弱.雙因素方差分析結(jié)果表明，木霉種類和干旱脅迫對(duì)木霉菌生物量存在交互作用，其中木霉種類顯著影響生物量(P<0.001,ηp2=0.810)(表2).

不同小寫字母表示不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理下木霉菌生物量存在顯著性差異(P<0.05).圖5 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對(duì)木霉菌生物量的影響Fig.5 Effect of different PEG-6000 mass concentrations on biomass of Trichoderma spp.

表2 木霉種類和干旱脅迫對(duì)木霉菌生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的雙因素方差分析Tab.2 Two-factor analysis of variance of Trichoderma species and drought stress on the growth and physiological indexes of Trichoderma spp.

2.5 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對(duì)木霉菌可溶性蛋白含量的影響

由圖6可知，隨干旱程度增強(qiáng)，除T.lixii和T.inhamatum外，其他木霉菌可溶性蛋白含量先降后升.其中，PEG-6000質(zhì)量濃度240 g/L時(shí)T.afroharzianum、T.atroviride、T.longibrachiatum和T.virilente可溶性蛋白含量最高，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05).而T.lixii隨脅迫程度增強(qiáng)，可溶性蛋白含量先升后降；正常水分時(shí)，可溶性蛋白含量最低，為6.98 mg/g；PEG-6000質(zhì)量濃度120 g/L時(shí)，可溶性蛋白含量最高，為9.84 mg/g，顯著高于對(duì)照組41.09%.5種木霉菌(除T.lixii和T.brevicompactum外)可溶性蛋白含量在PEG-6000質(zhì)量濃度60 g/L時(shí)最低.PEG-6000質(zhì)量濃度240 g/L時(shí)，T.afroharzianum、T.atroviride、T.longibrachiatum和T.virilente可溶性蛋白含量最高，均顯著高于對(duì)照組.雙因素方差分析結(jié)果表明，木霉種類和干旱脅迫對(duì)木霉菌可溶性蛋白含量存在交互作用，干旱脅迫顯著影響可溶性蛋白含量(表2).

不同小寫字母表示不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理下木霉菌可溶性蛋白含量存在顯著性差異(P<0.05).圖6 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對(duì)木霉菌可溶性蛋白含量的影響Fig.6 Effect of different PEG-6000 mass concentrations on soluble protein content of Trichoderma spp.

2.6 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對(duì)木霉菌SOD活性的影響

由圖7可知，隨干旱程度增強(qiáng)，不同木霉菌SOD活性(以鮮重酶單位U/(g·h)-1表示，簡(jiǎn)寫為U)表現(xiàn)出一定差異.干旱脅迫下，T.afroharzianum和T.virilenteSOD活性先降后升.T.afroharzianum在PEG-6000質(zhì)量濃度60 g/L時(shí)，SOD活性最低，為118.60 U，比對(duì)照組低31.13%；而T.virilente在PEG-6000質(zhì)量濃度120 g/L時(shí)，SOD活性最低，為18.60 U，比對(duì)照組低77.90%；PEG-6000質(zhì)量濃度為240 g/L時(shí)兩者SOD活性最大，均顯著高于對(duì)照組(P<0.05).而T.brevicompactum隨干旱程度增強(qiáng)，SOD活性呈先升后降趨勢(shì)，PEG-6000質(zhì)量濃度60 g/L時(shí)，SOD活性(799.74 U)顯著高于對(duì)照組119.93%.PEG-6000質(zhì)量濃度高于120 g/L時(shí)，T.afroharzianum、T.virilente和T.inhamatum的SOD活性高于其他處理組，且差異顯著(P<0.05).雙因素方差分析結(jié)果表明，木霉菌種和干旱脅迫對(duì)木霉菌SOD活性存在交互作用，其中木霉種類顯著影響SOD活性(P<0.001,ηp2=0.581)(表2).

2.7 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對(duì)木霉菌MDA含量的影響

由圖8可知，隨干旱程度增強(qiáng)，木霉菌MDA含量表現(xiàn)出一定差異.干旱脅迫下，T.afroharzianum的MDA含量呈先降后升，正常水分時(shí)，其MDA含量最大，為4.39 nmol/g；PEG-6000質(zhì)量濃度120 g/L時(shí)，其MDA含量最小，為1.84 nmol/g，顯著低于對(duì)照組58.18%.而T.brevicompactumMDA含量則呈先升后降，PEG-6000質(zhì)量濃度120 g/L時(shí)，MDA含量達(dá)最大，為9.30 nmol/g，顯著高于對(duì)照組179.65%；正常水分時(shí)，MDA含量最小，為3.33 nmol/g.對(duì)于T.inhamatum，隨干旱程度增強(qiáng)MDA含量呈升高趨勢(shì)，MDA含量最小為6.56 nmol/g；最大為16.64 nmol/g，顯著高于對(duì)照組153.74%.PEG-6000質(zhì)量濃度120 g/L時(shí)，T.longibrachiatum和T.virilenteMDA最低，與其他處理組相比差異顯著(P<0.05).而PEG-6000質(zhì)量濃度240 g/L時(shí)，T.virilente和T.inhamatumMDA含量最高，相比其他處理組也具有顯著差異.雙因素方差分析結(jié)果表明，木霉種類和干旱脅迫對(duì)木霉菌MDA含量存在交互作用，且木霉菌種發(fā)揮主要作用(表2).

2.8 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對(duì)木霉菌GSH含量的影響

由圖9可知，隨干旱程度增強(qiáng)，同一菌株GSH含量差異明顯；同一干旱程度下，不同木霉菌GSH含量也表現(xiàn)出一定差異.T.brevicompactum的GSH含量隨干旱程度增強(qiáng)呈先升后降.其中PEG-6000質(zhì)量濃度120 g/L時(shí)，其GSH含量最大，為1.23 μg/g，顯著高于對(duì)照組29.98%；PEG-6000質(zhì)量濃度為240 g/L時(shí)，其含量最小，為0.90 μg/g，比對(duì)照組低4.28%.而T.inhamatum的GSH含量則呈先降后升，在PEG-6000質(zhì)量濃度為240 g/L時(shí)，T.inhamatum的GSH含量最大，為2.17 μg/g，顯著高于對(duì)照組90.20%，與其他木霉菌相比，其GSH含量最大.對(duì)于T.virilente，隨干旱程度增強(qiáng)GSH含量呈升高趨勢(shì)，GSH含量最小為0.70 μg/g,最大為2.04 μg/g，最大值高于對(duì)照組191.64%，差異顯著.雙因素方差分析結(jié)果表明，木霉種類和干旱脅迫對(duì)木霉菌GSH含量存在交互作用，且木霉菌種發(fā)揮主要作用(表2).

不同小寫字母表示不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理下木霉菌GSH含量存在顯著性差異(P<0.05).圖9 不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理對(duì)木霉菌GSH含量的影響Fig.9 Effect of different PEG-6000 mass concentrations on GSH content of Trichoderma spp.

2.9 不同木霉菌種生長(zhǎng)指標(biāo)和生理指標(biāo)主成分分析

如圖10所示，主成分分析表明，不同木霉菌種生長(zhǎng)和生理指標(biāo)存在差異.PC1和PC2累積貢獻(xiàn)率達(dá)94.5%；其中PC1貢獻(xiàn)率為78.2%，PC2貢獻(xiàn)率為16.3%.說明SOD和MDA是影響菌株差異的主要指標(biāo).

1-3.T.afroharzianum；4-6.T. atroviride；7-9.T. lixii；10-12.T. longibrachiatum；13-15.T.brevicompactum；16-18.T. virilente；19-21.T. inhamatum.圖10 不同木霉菌種生長(zhǎng)指標(biāo)和生理指標(biāo)主成分分析Fig.10 Principal component analysis of growth indexes and physiological indexes of different Trichoderma species

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，不同木霉菌落直徑和產(chǎn)孢量在不同質(zhì)量濃度PEG-6000處理間存在差異，說明不同木霉菌種對(duì)干旱脅迫的耐受力不同，其原因主要是菌種本身生理代謝特性以及環(huán)境變化的影響[17].隨干旱程度增強(qiáng)，木霉菌菌落直徑和產(chǎn)孢量整體呈降低趨勢(shì)，PEG-6000質(zhì)量濃度為240 g/L時(shí)，所有木霉菌菌落直徑和產(chǎn)孢量均顯著低于對(duì)照組；PEG-6000質(zhì)量濃度低于240 g/L時(shí)，木霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢受抑制程度較輕，這與尹大川等[18]研究結(jié)果相似.這說明木霉菌對(duì)輕度干旱脅迫具有較強(qiáng)耐受性，且菌落直徑與產(chǎn)孢量對(duì)干旱環(huán)境的響應(yīng)具有一致性.

木霉菌在干旱處理培養(yǎng)7 d后，不同菌種生物量表現(xiàn)出一定差異.T.atroviride和T.lixii生物量?jī)H在PEG-6000質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)高于對(duì)照組；說明干旱程度較低時(shí)，對(duì)兩者生長(zhǎng)并無影響，隨干旱程度增強(qiáng)，木霉菌生長(zhǎng)受到抑制，這與王強(qiáng)強(qiáng)等[17]研究結(jié)果相一致.尹大川等[18]研究也表明輕度干旱脅迫對(duì)菌絲生物量無明顯抑制，隨著脅迫程度增強(qiáng)，菌絲生物量受到抑制.盧中科等[27]研究發(fā)現(xiàn)，輕度干旱脅迫有利于外生菌根真菌生物量積累，該結(jié)果也支持了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果.對(duì)于T.longibrachiatum，隨干旱程度增強(qiáng)，其生物量增加，說明該菌株對(duì)干旱環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性.

干旱條件下，細(xì)胞嚴(yán)重失水，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜崩解和消失[28].可溶性蛋白作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，使細(xì)胞膨壓得以維持，進(jìn)而保證菌株代謝活動(dòng)正常進(jìn)行[29].本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在PEG-6000質(zhì)量濃度240 g/L時(shí)，T.afroharzianum、T.atroviride、T.longibrachiatum和T.virilente可溶性蛋白含量均顯著高于對(duì)照組，說明這些木霉菌體內(nèi)可溶性蛋白對(duì)干旱脅迫響應(yīng)更為敏感，調(diào)節(jié)能力強(qiáng)，對(duì)干旱脅迫的耐受性更強(qiáng).

干旱脅迫還會(huì)引起活性氧積累，導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化，引起嚴(yán)重的生理傷害[30].生物體通過體內(nèi)SOD來清除菌體內(nèi)活性氧自由基，防止細(xì)胞膜受到傷害[29].SOD是一種抗氧化物酶，能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧，從而減輕超氧陰離子對(duì)細(xì)胞的毒害作用[31].MDA作為膜脂過氧化最終產(chǎn)物，是反映氧化損傷的有效指標(biāo)之一[32].本實(shí)驗(yàn)中，PEG-6000質(zhì)量濃度為240 g/L時(shí)，T.afroharzianum、T.lixii和T.virilente的SOD活性明顯增加，均顯著高于對(duì)照組，可能是菌株體內(nèi)存在調(diào)節(jié)抗氧化酶及關(guān)鍵酶活的基因，干旱程度的增強(qiáng)可能誘導(dǎo)木霉菌體內(nèi)此類功能基因的表達(dá)[33].這些菌株可通過積累SOD以清除體內(nèi)活性氧來降低干旱脅迫對(duì)其造成的傷害.Li等[34]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，深色有隔內(nèi)生真菌(dark septate endophytes,DSE)SOD活性明顯增加，以防止活性氧大量積累造成的毒害作用，在一定時(shí)間內(nèi)有助于DSE對(duì)脅迫環(huán)境的應(yīng)對(duì)和適應(yīng).對(duì)于T.brevicompactum，隨著干旱程度增強(qiáng)，SOD活性先升后降，PEG-6000質(zhì)量濃度60 g/L時(shí)，SOD活性顯著高于對(duì)照組；PEG-6000質(zhì)量濃度高于60 g/L，SOD活性急劇下降，說明干旱脅迫初期T.brevicompactum調(diào)動(dòng)抗氧化酶降低細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)積累，適應(yīng)外界的干旱環(huán)境；但隨著脅迫程度加深，其調(diào)節(jié)能力有限，當(dāng)達(dá)到一定脅迫程度后，其活性會(huì)下降，失去調(diào)節(jié)能力，菌株會(huì)受到嚴(yán)重傷害.干旱脅迫條件下，T.afroharzianum的MDA含量均低于對(duì)照組，說明T.afroharzianum能在一定程度上減弱膜脂過氧化產(chǎn)物MDA積累；其原因是該菌株SOD活性升高，及時(shí)清除了體內(nèi)活性氧自由基，使細(xì)胞膜免受傷害[35].

GSH作為一種抗氧化物質(zhì)，也可防止細(xì)胞過氧化，參與清除細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的多余活性氧自由基，在逆境脅迫下起著重要作用[36].本研究中，隨干旱程度增強(qiáng)，T.virilente的GSH含量呈升高趨勢(shì)，說明干旱脅迫下，T.virilente通過增加GSH含量來清除細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的多余H2O2，提高自身對(duì)干旱脅迫的耐受性.而T.brevicompactum的GSH含量隨干旱程度增強(qiáng)先升后降，說明T.brevicompactum抗氧化代謝系統(tǒng)功能低于T.virulent，7種木霉菌在干旱環(huán)境下表現(xiàn)出不同生長(zhǎng)特性，其中木霉種類和干旱脅迫對(duì)木霉菌的生長(zhǎng)及生理指標(biāo)均有影響.木霉菌種類顯著影響其SOD活性和GSH含量，說明木霉菌種可通過調(diào)節(jié)自身抗氧化保護(hù)系統(tǒng)來應(yīng)對(duì)干旱脅迫的不利影響.

綜上，本研究采用PEG-6000模擬干旱脅迫，通過測(cè)定木霉菌落直徑、產(chǎn)孢量、生物量等生長(zhǎng)指標(biāo)，以及MDA、GSH、可溶性蛋白和SOD等生理指標(biāo)，闡明了7種木霉菌在干旱環(huán)境下的生長(zhǎng)和生理特性，共篩選出4種耐旱性強(qiáng)的木霉菌種，分別為T.afroharzianum、T.atroviride、T.lixii和T.longibrachiatum.后續(xù)將這4種木霉菌接種至藥用植物，進(jìn)行不同干旱程度的室內(nèi)盆栽實(shí)驗(yàn)和田間實(shí)地試驗(yàn)；研究木霉菌如何影響植物生長(zhǎng)，以及能否緩解干旱脅迫對(duì)其造成的不利影響；探明木霉菌的功能和應(yīng)用潛力，為進(jìn)一步研制促生抗旱木霉菌劑提供依據(jù).