畢霄鶴，呂慧芳，倪鳳燕，章軍，劉艷，李建恒

(1.河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，中藥鑒定與安全性檢測(cè)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；3.河北中石油中心醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 廊坊 065000；4.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004)

玉竹，又名尾參、地管子、鈴鐺菜、葳蕤，為百合科多年生草本植物玉竹Polygonatumodoratum(Mill.)Druce的干燥根莖，分布很廣.《本草經(jīng)集注》云：“莖干強(qiáng)直，似竹箭桿，有節(jié)”，故有玉竹之名[1-2].玉竹所含化學(xué)成分主要有多糖類(lèi)、甾體皂苷類(lèi)、高異黃酮類(lèi)等化合物，其中多糖含量最高，也被視為其藥效成分.該藥材應(yīng)用十分廣泛，且是藥食兩用品種，廣泛應(yīng)用于保健品及食療中.研究表明，玉竹多糖是玉竹的主要有效成分，其具有滋陰補(bǔ)氣、生津止咳、延緩衰老、降低血糖、抑制腫瘤、增強(qiáng)免疫力等功效[3-4].

糖類(lèi)是中藥材中普遍存在的成分，如黃芪、枸杞、麥冬、靈芝、人參、桑葉、金櫻子等都存在具有生物活性的多糖成分[5].中藥多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等生物活性，藥效顯著且不良反應(yīng)少[6].但多糖相對(duì)分子質(zhì)量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，穩(wěn)定性差，且含多糖類(lèi)藥材在儲(chǔ)存過(guò)程中更易發(fā)生霉變、蟲(chóng)蛀等變質(zhì)現(xiàn)象，使其質(zhì)量難以控制，藥效難以保障，造成“古方雖效，今卻無(wú)用”的遺憾.欲提高藥材質(zhì)量，除加強(qiáng)藥材在道地產(chǎn)區(qū)的規(guī)范化種植管理外，還可將其單味飲片經(jīng)提取濃縮制成單味配方顆粒.單味中藥配方顆粒是以傳統(tǒng)中藥飲片為原料，經(jīng)規(guī)范化的提取、分離、濃縮、干燥、制粒等一系列工藝，制成的新型中藥飲片劑型，具有方便沖服、劑量精準(zhǔn)、性質(zhì)穩(wěn)定、易于攜帶與儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)，是國(guó)家對(duì)中醫(yī)藥行業(yè)大力發(fā)展與扶持的新型項(xiàng)目[7].如何保障配方顆粒的質(zhì)量，確定多糖有效成分群劑量以確保準(zhǔn)確用藥呢？

解決上述問(wèn)題，需建立中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)一步科學(xué)規(guī)范量化藥材質(zhì)量，保障臨床療效.中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是指按照一定的現(xiàn)代化工藝，采用準(zhǔn)確、規(guī)范、可靠的試劑和方法制備的現(xiàn)代化中藥[8].它具有不同于藥材和配方顆粒獨(dú)特的質(zhì)量控制優(yōu)勢(shì)，與藥材相比，標(biāo)準(zhǔn)湯劑能表明制備工藝的影響；與配方顆粒相比，標(biāo)準(zhǔn)湯劑不存在輔料的干擾，更接近傳統(tǒng)用藥形式.既保留了傳統(tǒng)的水煎湯劑形式，又具有用于量化標(biāo)準(zhǔn)的參數(shù)，如指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率、得膏率等.它可作為一種化學(xué)基準(zhǔn)，用于指導(dǎo)不同飲片用藥形式和臨床用藥，為中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參比[9].

本文研究的玉竹具有豐富的藥理作用，美容養(yǎng)顏且易于獲取，其多糖具有多靶向無(wú)毒性等優(yōu)勢(shì)，對(duì)玉竹的研究終將會(huì)越來(lái)越重視，因此需加強(qiáng)對(duì)玉竹的質(zhì)量評(píng)價(jià)及質(zhì)量控制[10].本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用科學(xué)現(xiàn)代化的技術(shù)制備不同產(chǎn)地的12批玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，考察多糖組分群的含量、轉(zhuǎn)移率和得膏率范圍，并建立其特征指紋圖譜，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制，為玉竹在食品、藥品及化妝品領(lǐng)域的發(fā)展提供參考標(biāo)準(zhǔn)，為玉竹飲片配方顆粒及其他含有多糖的藥材質(zhì)控提供更多的參考價(jià)值.

1 儀器與試藥

島津LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器公司，T6新世紀(jì))；BS224S-型1/10萬(wàn)電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；XW-80A型漩渦混合儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)KQ；PB-10型pH計(jì)(Sartorius公司).

無(wú)水葡萄糖對(duì)照品來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為：3D4D-GV52，w(葡萄糖)≥99.5%；甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher)；水為娃哈哈純凈水；硫酸、苯酚等其他試劑為分析純.從3個(gè)產(chǎn)地收集了共12批玉竹樣品，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所孫偉副研究員鑒定為百合科植物玉竹Polygonatumodoratum(Mill.)Druce的干燥根莖，其信息見(jiàn)表1.

表1 玉竹樣品信息Tab.1 Information of polygonatum odoratum samples

2 方法與結(jié)果

2.1 玉竹飲片多糖含量測(cè)定

據(jù)2015版《中華人民共和國(guó)藥典》方法進(jìn)行測(cè)定，得到12批玉竹飲片中多糖的含量，以無(wú)水葡萄糖(C6H12O6)計(jì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 8.1%～14.8%(表2).結(jié)果表明，所收集12批玉竹樣品均滿(mǎn)足2015版藥典中玉竹項(xiàng)下規(guī)定.

表2 玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑測(cè)定Tab.2 Results of standard decoction of Polygonatum odoratum pieces

2.2 玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備與測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

按《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》中原則，建立玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法.稱(chēng)取玉竹飲片100 g置圓底燒瓶中，煎煮回流2次.一煎先加7倍水浸泡0.5 h，后加熱回流1 h，立即過(guò)200目(75 μm)篩.二煎加6倍水不浸泡，立即加熱回流40 min，趁熱過(guò)200目(75 μm)篩.合并2次煎煮回流得到的濾液，40 ℃溫水浴條件下進(jìn)行減壓濃縮至500 mL，即得.

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH值的測(cè)定

取各批次玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，測(cè)定pH值，平行2次，結(jié)果見(jiàn)表2.

2.2.3 出膏率測(cè)定

取各批玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑，搖勻后用移液管精密吸取10 mL，放入恒重蒸發(fā)皿中，用水浴蒸干，再在105 ℃烘箱中干燥3 h，干燥完畢立刻取出放入干燥器中冷卻0.5 h，然后稱(chēng)重.平行2次，測(cè)得出膏率為45.4%～70.1%，計(jì)算得到平均出膏率為55.6%，結(jié)果如表2.

2.3 玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑多糖含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定D-無(wú)水葡萄糖30.64 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至接近刻度線，超聲，放冷，加水定容，制成每1 mL含0.612 8 mg D-無(wú)水葡萄糖的溶液.

2.3.2 40 g/L苯酚的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取苯酚4.0 g，用純凈水溶解并定容于100 mL的棕色容量瓶?jī)?nèi)，避光保存，臨用時(shí)配制.

2.3.3 供試品溶液的制備

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密量取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液1.5、2.0、3.0、5.0、7.0 mg/mL，分別置于50 mL量瓶中，各加水至50 mL刻度，搖勻.分別精密量取上述溶液2 mL，置具塞試管中，分別加入40 g/L苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入硫酸7 mL，搖勻，置40 ℃水浴中保溫30 min，取出，置冰水浴中放置5 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)得吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到D-無(wú)水葡萄糖的回歸方程：Y=10.05X+0.011，R2=0.998.結(jié)果表明，D-無(wú)水葡萄糖在0.018 4～0.085 8 mg/mL內(nèi)與其吸光度呈良好線性關(guān)系.

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取已顯色的玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，在490 nm下重復(fù)測(cè)定6次吸光度，計(jì)算其RSD為0.1%(n=6)，表明該方法精密度良好.

2.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批的玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑，平行制備成6份玉竹供試品溶液，按2.3.4項(xiàng)下操作方法，測(cè)量吸光度.計(jì)算得到玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑中D-無(wú)水葡萄糖的平均質(zhì)量濃度為4.72 mg/mL，RSD 為2.7%，表明該方法的重復(fù)性良好.

2.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取已顯色的玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h在490 nm下測(cè)定吸光度.結(jié)果表明，顯色后的溶液隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度逐步下降，應(yīng)當(dāng)在顯色后4 h內(nèi)測(cè)定.

人力資源管理工作主要的工作內(nèi)容，首先企業(yè)所有人員的檔案管理工作，按照部門(mén)將所有的公司員工檔案進(jìn)行合理的儲(chǔ)存；其次，是企業(yè)員工動(dòng)態(tài)流動(dòng)的相應(yīng)人事記錄；最后，是對(duì)整個(gè)企業(yè)的工作人員的綜合管理及分析應(yīng)用。在整個(gè)人力資源管理工作之中，由于工作內(nèi)容繁多，企業(yè)相應(yīng)的人力資源管理人員業(yè)務(wù)水平存在缺陷等情況，都會(huì)導(dǎo)致整個(gè)企業(yè)的人力資源管理體系存在漏洞，從而給整個(gè)企業(yè)的正常發(fā)展帶來(lái)隱患，對(duì)于企業(yè)的員工而言，企業(yè)的人事工作效率低下，無(wú)法迅速為企業(yè)的人事運(yùn)轉(zhuǎn)工作提供高效支撐，從而影響到企業(yè)的運(yùn)行效率。

2.3.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取已知多糖質(zhì)量濃度4.72 mg/mL的玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，以多糖含量計(jì)按質(zhì)量比1∶1添加D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(1.225 mg)，并平行制備6 份供試品溶液，2.3.4項(xiàng)下操作方法，計(jì)算得多糖回收率為 98.3%，RSD 為 2.8%，表明該方法準(zhǔn)確度較好.

2.3.9 樣品測(cè)定

取12批玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按2.3.4項(xiàng)下操作方法，測(cè)量吸光度.每個(gè)批次平行2 份，結(jié)果見(jiàn)表2.

2.4 玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率

玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率為

其中，W為玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑中目標(biāo)成分的質(zhì)量(mg)，M為玉竹飲片中目標(biāo)成分的質(zhì)量(mg).以D-無(wú)水葡萄糖計(jì)，計(jì)算得多糖的轉(zhuǎn)移率為10.9%～31.7%，平均轉(zhuǎn)移率為21.25%，結(jié)果如表2.

2.5 玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜的建立

2.5.1 色譜條件

色譜柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相(體積分?jǐn)?shù))：A-乙腈，B-0.25% 磷酸水溶液，梯度洗脫(0～30 min，5%～23% A;30～40 min，23% ～38% A)；柱溫為35 ℃;流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣量 10 μL.在此條件下，特征圖譜能顯示較多的信息，見(jiàn)圖1.

圖1 玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜Fig.1 HPLC specific chromatograms of standard decotion of Polygonatum odoratum pieces

2.5.2 供試品溶液的制備

精密量取玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑10 mL搖勻，置20 mL量瓶中，加10 mL甲醇，超聲處理10 min，用水定容后搖勻，用微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得.

2.5.3 樣品測(cè)定與分析

取各批玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按2.5.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.5.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，得到HPLC 圖，如圖2.共標(biāo)定5個(gè)共有峰，以2號(hào)峰為參照.利用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A)，時(shí)間窗設(shè)為0.2，采用中位數(shù)法，對(duì)各批供試品色譜圖進(jìn)行相似度計(jì)算，如表3.結(jié)果得到各批玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均大于0.9，表明各批玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑一致性較好.

圖2 12 批玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 12 batches Polygonatum odoratum pieces

表3 12批玉竹飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的相似度Tab.3 Fingerprint similarities of 12 batches of standard decoction of Polygonatum odoratum pieces

3 討論

本文研究的12批玉竹，盡量遵循多產(chǎn)地、多規(guī)格、多批次、多等級(jí)的要求，使研究樣品的代表性決定標(biāo)準(zhǔn)湯劑的代表性.本文研究的樣本其中7批來(lái)自于主產(chǎn)區(qū)湖南，4批產(chǎn)于河北，1批產(chǎn)于遼寧.湖南是玉竹的道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū),栽培面積大，歷史悠久，主產(chǎn)于湖南的玉竹又被稱(chēng)做“湘玉竹”，因而本研究選擇了較多來(lái)自湖南的樣品，以期具有更好的代表性.所有樣品其質(zhì)量均符合《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定，滿(mǎn)足研究的需要.

玉竹飲片中多糖的轉(zhuǎn)移率為10.9%～31.7%，批次間轉(zhuǎn)移率差異較大，造成這種結(jié)果的原因可能是玉竹飲片的厚度不同造成的.2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定，玉竹的炮制方法為切厚片或段，在制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑過(guò)程中，薄的玉竹飲片中多糖含量比厚的玉竹飲片提取的更完全，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)移率偏高.經(jīng)測(cè)量與觀察，玉竹S2、S9、S10飲片厚度明顯較其他批次薄.玉竹飲片的出膏率為45.4%～70.1%，批次間得膏率差異也較大，且得膏率與轉(zhuǎn)移率基本呈正相關(guān)，因此推斷造成這種結(jié)果的原因可能是批次間玉竹飲片的厚度不同造成的，與轉(zhuǎn)移率差異較大的原因相同.在制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑過(guò)程中，薄的玉竹飲片中多糖比厚的玉竹飲片中提取的更完全，進(jìn)而得膏率偏高.

在12批玉竹指紋圖譜中選取了5個(gè)分離度和峰形較好的峰作為共有峰對(duì)玉竹進(jìn)行鑒別和質(zhì)量控制，后期會(huì)對(duì)共有峰所代表的成分通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行進(jìn)一步明確.

多糖是中藥中含量最高的一類(lèi)成分，其具有廣泛的生物活性，包括抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗突變、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和美容養(yǎng)顏等方面的作用.比如黃芪多糖調(diào)節(jié)免疫功能作用明顯；何首烏多糖降血脂作用顯著；忍冬藤多糖可以抗氧化并延緩衰老等[11].多糖藥效高且毒副作用小，具有很大的開(kāi)發(fā)潛力.標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定為多糖的開(kāi)發(fā)利用提供參考標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)避了因提取不規(guī)范造成的藥效差異，提供了中藥材使用水準(zhǔn).

雖然有關(guān)飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究已經(jīng)有較多的報(bào)道，理清了很多關(guān)鍵問(wèn)題.然而這些研究均是以單體成分為含測(cè)指標(biāo)，主要關(guān)注某個(gè)或某幾個(gè)單體成分，忽略了對(duì)某一類(lèi)或幾類(lèi)有效成分群的含量測(cè)定.雖然單體成分的含量測(cè)定更為準(zhǔn)確、方便，但是有效成分群的含量具有更廣泛的代表性，與藥效的關(guān)系也更為密切.因此在標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定中，不應(yīng)該忽略有效成分群的含量測(cè)定.以玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑為示范性研究對(duì)象，明確其制備方法，建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為玉竹及其他含多糖藥材的配方顆粒制備及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考.

4 總結(jié)

12批玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度均大于0.9，均一性較好，質(zhì)量穩(wěn)定，本研究采用的苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量，操作簡(jiǎn)單，快速，靈敏.方法學(xué)考察結(jié)果表明，儀器精密度、樣品穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD均小于3%.因此，該方法能為玉竹標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量研究及其配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，同時(shí)也為含有多糖成分的黃芪、枸杞、麥冬、靈芝等飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及其配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考.