顏 輝 吳 鋼 王 樂 王 順 毛 帥 江 洪 黃從新

慢性心力衰竭是多種原因?qū)е滦募∩溲芰?或)心室充盈功能下降的臨床綜合征，也是大多數(shù)心臟疾病發(fā)生、發(fā)展的終末階段[1]。慢性心力衰竭的主要病理特征之一是自主神經(jīng)失平衡，包括交感神經(jīng)系統(tǒng)功能亢進(jìn)和迷走神經(jīng)功能減弱。交感神經(jīng)的過度激活會(huì)促使心肌細(xì)胞凋亡增加和炎性反應(yīng)持續(xù)產(chǎn)生[2]。抑制交感神經(jīng)的活性是治療慢性心力衰竭的重要手段。星狀神經(jīng)節(jié)是心臟交感神經(jīng)支配的重要成分。2012年Concei?o-Souza等[3]進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性隨機(jī)試驗(yàn)，初步證明左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除治療收縮性心力衰竭是安全的和有效的。本研究旨在探索左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除對慢性心力衰竭心功能的影響及其機(jī)制，為臨床治療慢性心力衰竭提供依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本研究中的所有動(dòng)物程序均經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物中心提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(動(dòng)物合格證編號(hào)：00270753)。動(dòng)物使用過程嚴(yán)格按照北京大學(xué)制定的《動(dòng)物保護(hù)與使用指南》執(zhí)行。由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物中心提供SPF級(jí)雄性大鼠24只，8周齡，平均體質(zhì)量為200～250g。采用數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，即對照組(腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)，n=8)、LSG組(左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除+腹主動(dòng)脈縮窄術(shù),n=8)和假手術(shù)組(左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除假手術(shù)+腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)，n=8)。

2.試劑與儀器：無水乙醇、二甲苯購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘇木精染液、伊紅染液購自美國Aspen公司；大鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購自英國Abcam公司；caspase-3、caspase-9抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；脫水機(jī)、包埋機(jī)、凍臺(tái)、組織攤片機(jī)購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)購自上海徠卡儀器有限公司；小動(dòng)物手術(shù)器械購自新華手術(shù)器械有限公司。

3.構(gòu)建壓力超負(fù)荷心力衰竭模型：大鼠在動(dòng)物中心適應(yīng)環(huán)境1周后，3組大鼠均行腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)心力衰竭模型造模。取仰臥位固定，腹腔內(nèi)注射50mg/kg戊巴比妥鈉麻醉成功后，在腹中段沿腹正中線做約2cm切口，鈍性分離暴露腹主動(dòng)脈，以22G號(hào)針頭結(jié)扎，取出針頭，制造約0.7mm直徑的殘腔，逐層縫合關(guān)閉切口，術(shù)后2天大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸和心跳加速、畏寒倦怠和食欲減退等癥狀，提示手術(shù)造模成功。

4.左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除：LSG組大鼠在完成腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后進(jìn)行左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除手術(shù)。大鼠取仰臥位固定，沿頸部正中做1cm長切口，鈍性分離后，顯微鏡下找到頸上神經(jīng)節(jié)，距其下端3mm處離斷星狀神經(jīng)節(jié)，斷端結(jié)扎，縫合切口。術(shù)后5min內(nèi)出現(xiàn)左側(cè)眼球內(nèi)陷、瞳孔縮小及上瞼下垂等表現(xiàn)提示手術(shù)成功。假手術(shù)組僅進(jìn)行左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)分離，不予切除，逐層縫合，關(guān)閉切口。腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)10周。

5.超聲心動(dòng)圖檢測：腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后10周行超聲心電圖檢測，在二維超聲引導(dǎo)下，探頭在胸骨旁左心室長軸切面掃描，采集M型超聲心動(dòng)圖，測量室間隔厚度(intra-ventricular septum diastole, IVSD)、左心室后壁舒張末期厚度(left ventricular posterior wall diameter, IVPWD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDd)、左心室舒張末期容積 (left ventricular end diastolic volume, LVEDV)，取測量的3個(gè)心動(dòng)周期的平均值，并按照Teichholt 公式計(jì)算出左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fraction shortening, LVFS)，評估大鼠心腔大小和射血功能。

6.心臟組織HE染色：大鼠處死后，立刻用眼科小剪刀剪取大鼠心尖部約5mm×5mm×5mm心肌組織，制備石蠟切片，各組隨機(jī)選取3張切片，然后進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡(×400)下觀察心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和病理改變(心肌細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)，心肌纖維排列，炎性細(xì)胞浸潤)。

7.酶聯(lián)免疫吸附測定檢測心肌炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平：獲取心肌組織，組織勻漿，稀釋待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品至合適濃度，按100微升/孔加入到酶標(biāo)板中，4℃過夜。TNF-α和IL-6抗體用稀釋液，加入100微升/孔，在37℃環(huán)境下放置到濕盒45min。然后洗板3次。加入親和素過氧化物酶復(fù)合物工作液100μl，在37℃環(huán)境下反應(yīng)30min，依次加入TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)30min，最后加入50μl終止液，用ELISA檢測儀于450nm波長處測定吸光度值。

8.蛋白印跡檢測心肌組織凋亡蛋白caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)：獲取心肌組織，蛋白提取試劑盒收集細(xì)胞蛋白，測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。4℃環(huán)境下加入1∶100到1∶500稀釋兔抗大鼠caspase-3、caspase-9多克隆抗體孵育過夜，加入1∶1000稀釋HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，室溫孵育30min，顯色系統(tǒng)中顯色定影，分析雜交條帶。

結(jié) 果

1.各組超聲心動(dòng)圖心功能指標(biāo)比較：各組超聲心動(dòng)圖心功能指標(biāo)IVSD、LVPWD、LVEDd、LVEDV、LVEF、LVFS比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LSG組IVSD、IVPWD較對照組和假手術(shù)組低(P均<0.05),LVEDd、LVEDV較對照組和假手術(shù)組低(P均<0.05)，LVEF、LVFS較對照組和假手術(shù)組高(P均<0.05)。對照組和假手術(shù)組比較，心功能指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1，表1)。

表1 術(shù)后10周各組大鼠心功能的比較

圖1 術(shù)后10周各組大鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果A.對照組;B.LSG組;C.假手術(shù)組

2.各組心肌肥厚程度比較:各組HE染色結(jié)果顯示，LSG組心肌細(xì)胞排列較規(guī)則整齊，而對照組和假手術(shù)組的心肌細(xì)胞空泡化，細(xì)胞間隙明顯，部分細(xì)胞溶解(圖2)。

圖2 術(shù)后10周各組大鼠心肌HE染色結(jié)果(×400)A.對照組;B.LSG組;C.假手術(shù)組

3.各組心肌組織炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平比較：LSG組炎性細(xì)胞因子明顯低于對照組和假手術(shù)組，這說明LSG可以顯著改善慢性心力衰竭的心臟炎性水平(表2)。

表2 術(shù)后10周各組大鼠心肌炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6比較

4.各組心肌組織凋亡蛋白caspase-3和caspase-9表達(dá)量比較：LSG組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)低于對照組和假手術(shù)組，這說明在心力衰竭第10周時(shí)，LSG可以明顯減少慢性心力衰竭心肌細(xì)胞凋亡(圖3)。

圖3 術(shù)后10周各組大鼠心肌組織caspase-3和caspase-9表達(dá)

討 論

本研究建立腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后慢性心力衰竭大鼠模型，行左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除手術(shù)，觀察其對慢性心力衰竭大鼠心功能的影響。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后10周，LSG組炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平明顯下降,凋亡蛋白caspase-3、caspase-9表達(dá)水平顯著降低，心功能明顯好轉(zhuǎn)。

慢性心力衰竭是一種進(jìn)展性病程，從代償性心肌肥厚逐漸發(fā)展到心室重構(gòu)及心肌纖維化，最終走入失代償性終末期階段[4,5]。眾所周知，抑制交感神經(jīng)的活性是治療慢性心力衰竭的重要手段，比如藥物治療β受體阻滯劑。長期服用β受體阻滯劑可以明顯改善慢性心力衰竭嚴(yán)重程度和提高慢性心力衰竭患者的生活質(zhì)量。交感神經(jīng)節(jié)切除是抑制交感神經(jīng)活性的重要方法，主要用于遺傳性室性心律失常如長QT綜合征和環(huán)肺靜脈消融的治療。既往研究證實(shí)，左側(cè)心臟交感神經(jīng)去神經(jīng)可減輕長QT綜合征和兒茶酚胺能多形性室性心動(dòng)過速患者的室性心律失常發(fā)作，也可能對治療其他通道病和心肌病患者有利[6,7]。雙側(cè)心臟交感神經(jīng)去神經(jīng)支配可以降低室性心動(dòng)過速或心室顫動(dòng)的誘發(fā)性，并減輕交感神經(jīng)激活對梗死心臟復(fù)極的影響[8]。

心臟交感神經(jīng)節(jié)切除用于慢性心力衰竭治療尚在探索之中。星狀神經(jīng)節(jié)由第1胸神經(jīng)節(jié)與頸下神經(jīng)節(jié)融合而成，是心臟交感神經(jīng)支配的重要通路。多項(xiàng)研究表明，星狀神經(jīng)節(jié)干預(yù)治療心力衰竭是可行的及有效的。即使全部切除左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)后，右側(cè)交感神經(jīng)輸出仍然存在[9]。鄭建濱等[10]研究顯示，腹主動(dòng)脈縮窄法建立大鼠心力衰竭模型后，以0.1%利多卡因阻滯右側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)持續(xù)2周，與對照組和假手術(shù)組比較，星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠的TNF-α、IL-1β水平較低，PI3K、Akt蛋白相對表達(dá)量較高,caspase-3蛋白相對表達(dá)量較低，高倍鏡視野下TUNEL染色平均陽性數(shù)較少。Zhang等[11,12]研究慢性心力衰竭大鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，雙側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除可以通過下調(diào)交感神經(jīng)激素的表達(dá)，使得纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原纖維和Ⅲ型膠原纖維等心肌纖維化標(biāo)志物明顯減少，進(jìn)而減輕心肌肥厚，改善心功能。這說明雙側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除可以減輕慢性心力衰竭的心室重構(gòu)和心肌纖維化水平。最近的另外一項(xiàng)研究顯示，在星狀神經(jīng)節(jié)切除后10周，左側(cè)、右側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除組較對照組Ⅰ型膠原纖維，以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維的比值低(P=0.000)，慢性心力衰竭大鼠心功能明顯好轉(zhuǎn)[13]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭和炎癥密切相關(guān)。炎性反應(yīng)已被證實(shí)參與慢性心力衰竭整個(gè)演變過程[14]。炎性細(xì)胞因子可以誘發(fā)心肌肥厚、心肌纖維化、左心室功能障礙和細(xì)胞凋亡[15]。炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6和慢性心力衰竭嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[16]。通過抑制炎性反應(yīng)來改善心臟功能已被廣泛討論并研究。最新有研究報(bào)道稱交感神經(jīng)系統(tǒng)可以調(diào)控心臟局部炎癥。在心力衰竭中晚期階段，隨著交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性持續(xù)增高，交感神經(jīng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)過度激活可能促使心力衰竭產(chǎn)生持續(xù)性的炎性反應(yīng)[2]。在壓力超負(fù)荷時(shí)，交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活會(huì)通過p53信號(hào)通路上調(diào)細(xì)胞間黏附分子-1和整合素表達(dá)，加重心功能障礙，從而促進(jìn)心臟炎性反應(yīng)[17]。有研究者提出，通過抑制過度興奮的交感神經(jīng)功能抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和細(xì)胞凋亡是可行的。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，LSG組TNF-α、IL-6水平明顯下降，這說明左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除可以抑制慢性心力衰竭大鼠的心臟炎癥。

隨著心力衰竭機(jī)制研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與心力衰竭關(guān)系密切。近年來國內(nèi)研究表明，星狀神經(jīng)節(jié)阻滯能夠通過增強(qiáng) PI3K/Akt 信號(hào)通路，降低凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，從而減輕左心室肥厚并改善心功能[18]。星狀神經(jīng)節(jié)切除是否同樣具有抑制心肌細(xì)胞凋亡來改善心力衰竭心功能的作用，目前暫沒有相關(guān)研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后10周，LSG組凋亡蛋白caspase-3、caspase-9表達(dá)水平顯著降低。本研究證實(shí)了左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除可以抑制慢性心力衰竭大鼠的心肌細(xì)胞凋亡。

本研究存在的不足：①未進(jìn)行細(xì)胞層面及相關(guān)的信號(hào)通路研究；②未進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除對慢性心力衰竭治療效果；③本研究缺乏左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除與臨床一線藥物如β受體阻滯劑的對比研究。

綜上所述，本研究表明，左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)切除通過抑制心臟炎癥和心肌細(xì)胞凋亡明顯改善慢性心力衰竭大鼠心功能。