陳 鳳 程 韜 王影超 鄒轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 舒 柯

貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽(yáng) 550004

本品為蕓香科植物飛龍掌血屬Toddaliaasiatica(L.)Lam.的飛龍掌血根，全株用作草藥，多用其根，具有活血散瘀、祛風(fēng)除濕、消腫止痛之功效，治療感冒風(fēng)寒、胃痛、肋間神經(jīng)痛、風(fēng)濕骨痛、跌打損傷、咯血等[1]。目前已知飛龍掌血中化學(xué)成分包括呋喃香豆素類、毗喃香豆素類、生物堿類等及其他化學(xué)成分[2]。其中白屈菜紅堿具有具有抗菌、抑菌，清熱解毒、抗菌消炎的作用[3-4]與飛龍掌血根的臨床療效具有相關(guān)性。目前貴州省收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中[5]，僅用其根皮。但是若僅僅使用根皮而不使用根，不僅是對(duì)中藥資源的一種巨大浪費(fèi)，也不利于中藥材的可持續(xù)發(fā)展。因此采用高效液相色譜對(duì)飛龍掌血根中白屈菜紅堿進(jìn)行含量測(cè)定，以達(dá)到完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及用藥安全有效，質(zhì)量可控穩(wěn)定，為生產(chǎn)、使用、流通等提供科學(xué)合理數(shù)據(jù)參考。飛龍掌血根生境及性狀如圖1所示。

圖1 飛龍掌血生境圖(A)、飛龍掌血根性狀圖(B)

1 材料與儀器

1.1 儀器 Waters 2695-2998高效液相色譜儀(美國(guó))，KQ-500DA超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，MS204TS型(萬(wàn)分之一)電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、XP26型(百萬(wàn)分之一)電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試劑與試藥 乙腈為色譜純，分析甲醇、分析三乙胺、分析磷酸，水為超純水。飛龍掌血根12批樣品；白屈菜紅堿(批號(hào)：111718-201402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：80.5%)中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為乙腈—1%三乙胺(磷酸調(diào) pH 值至 3)(28∶72)；檢測(cè)波長(zhǎng)為269 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取白屈菜紅堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取飛龍掌血根藥材，粉碎，過三號(hào)篩，混勻，取粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)充減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液，照“色譜條件”項(xiàng)下進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果供試品與對(duì)照品在相應(yīng)的位置出現(xiàn)色譜峰，色譜圖如圖2所示。

圖2 對(duì)照品(A)、供試品(B)的HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、15 μL、20 μL注入高效液相色譜儀器，測(cè)定峰面積。計(jì)算回歸方程：y=248,901.4450x- 5,802.7829，r=1.0000(n=6),表明白屈菜紅堿在0.059828～0.598276 μg的進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定白屈菜紅堿的峰面積，計(jì)算其RSD%為0.66%，結(jié)果表明，儀器精密度好。

2.7 耐用性試驗(yàn) 取同一樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備1份供試品溶液，分別于0、2 h、6 h、10 h、14 h、18 h、24 h各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定白屈菜紅堿的峰面積，計(jì)算RSD為0.49%，結(jié)果表明，供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣量10μL，測(cè)定白屈菜紅堿的峰面積，平均含量0.7987 mg/g，計(jì)算RSD為0.18%，表明該方法重復(fù)性好。

2.9 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取已測(cè)定含量的飛龍掌血根藥材樣品(平均含量0.7987 mg/g)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入白屈菜紅堿對(duì)照品(0.016261 mg，具體見表1)20 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并計(jì)算白屈菜紅堿的平均回收率99.42%，RSD為1.63%。見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 不同色譜柱的考察 取同一樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備1份供試品溶液，分別以不同品牌C18色譜柱(Waters Xbridge 、Thermo Fisher、Agilent XDB)各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定白屈菜紅堿的峰面積，計(jì)算含量，RSD%為0.88%，結(jié)果表明不同品牌十八烷基硅膠膠合硅膠為填充劑的色譜柱對(duì)含量測(cè)定無顯著差異。

2.11 樣品含量測(cè)定 按上述色譜條件，取不同產(chǎn)地飛龍掌血根“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定白屈菜紅堿的含量，結(jié)果見表2。12批飛龍掌血根藥材中白屈菜紅堿含量測(cè)定結(jié)果為0.3274～1.5771 mg/g。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地的飛龍掌血根中白屈菜紅堿的含量存在著明顯的差異，其次即使是同一產(chǎn)地不同采收季節(jié)的含量之間也存在著較大的差異。本實(shí)驗(yàn)建立的方法可以進(jìn)一步對(duì)飛龍掌血根藥材的研究開發(fā)及臨床合理使用，提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此在藥用的時(shí)候，應(yīng)該根據(jù)其產(chǎn)地及采收季節(jié)來確定其劑量，以免因其量過多或者過少而影響治療效果。

本次實(shí)驗(yàn)還對(duì)飛龍掌血根莖藥材和飛龍掌血根皮藥材進(jìn)行定位對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們都含有白屈菜紅堿、血根堿、氯化兩面針堿、茵芋堿和茴芹香豆素、異茴芹香豆素，從實(shí)驗(yàn)來看飛龍掌血根和根皮之間的成分差異并不大，但是由于實(shí)驗(yàn)材料采集局限性，無法更加全面系統(tǒng)的對(duì)二者進(jìn)行完整的對(duì)比。在本次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，下一步將研究飛龍掌血根莖及根皮中有效成分的含量。

本次實(shí)驗(yàn)考察白屈菜紅堿吸收波長(zhǎng)，取白屈菜紅堿對(duì)照溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，經(jīng)試驗(yàn)摸索，以269 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)以獲得較高的靈敏度和良好的選擇。故確定白屈菜紅堿的檢測(cè)波長(zhǎng)為269 nm。研究比較不同流動(dòng)相的洗脫效果，用乙腈-1%三乙胺(磷酸調(diào)pH值至3)(28∶72)[6]作為流動(dòng)相。對(duì)不同濃度的甲醇進(jìn)行超聲及回流提取對(duì)比研究，結(jié)果表明，本法選擇甲醇回流加熱30 min效果最好。本實(shí)驗(yàn)對(duì)飛龍掌血根中白屈菜紅堿的含量測(cè)定的研究，方法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便易行，可用于飛龍掌血根質(zhì)量控制。