吳遠(yuǎn)波 焦 濤

1.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，江西 南昌 330006；2. 遼寧省丹東市市場監(jiān)管事務(wù)服務(wù)中心藥檢部，遼寧 丹東 118002

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)自發(fā)生以來，由于其潛伏周期長、傳染性強(qiáng)、致病力強(qiáng)等特點[1]，在全國快速蔓延，給我國人民群眾的生命財產(chǎn)帶來巨大的損害。在新冠肺炎疫情早期沒有特效藥和疫苗的情況下，廣大中醫(yī)藥工作者認(rèn)真總結(jié)中醫(yī)藥治療病毒性傳染病的規(guī)律和經(jīng)驗，篩選有效方劑，促進(jìn)中醫(yī)藥深度介入新冠肺炎診療全過程[2]。國家中醫(yī)藥管理局組織實施應(yīng)急科研專項，在河北、山西、黑龍江、陜西四省開展試點臨床觀察，結(jié)果顯示清肺排毒湯治療新型冠狀病毒感染的肺炎患者總有效率可達(dá)90%以上[3]。在此基礎(chǔ)上，國家衛(wèi)生健康委員會和國家中醫(yī)藥管理局在2020年2月通知，推薦各地在新型冠狀病毒感染肺炎治療時使用清肺排毒湯[4]。在隨后的新冠肺炎診療中，清肺排毒湯被廣泛使用，有效減緩病情發(fā)展，臨床療效明顯[5-8]。

鑒于清肺排毒湯在抗疫工作中展示的確切療效和重大研究成果，及其在今后常態(tài)化防疫工作中的潛在作用，研制可工業(yè)化生產(chǎn)、質(zhì)量穩(wěn)定可控、使用方便的清肺排毒湯成方制劑將非常迫切。藥品質(zhì)量研究是藥品研發(fā)工作的基礎(chǔ)和前提，對中藥成方中有效成分的含量控制是對成方質(zhì)量控制的重要手段。清肺排毒湯出自《傷寒雜病論》中幾個經(jīng)典方劑，該藥處方由21味中藥組成，化學(xué)成分復(fù)雜，周嚴(yán)嚴(yán)等[9]基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)，鑒定推斷了清肺排毒湯中的87 個化合物，含43 個黃酮，9 個生物堿等，認(rèn)為黃酮類和生物堿化合物是清肺排毒湯中的主要化合物。而橙皮苷和黃芩苷是清肺排毒湯藥味中含量較高的兩種黃酮類成分[10]，因此對橙皮苷和黃芩苷兩種黃酮類成分進(jìn)行含量控制研究具有重要意義。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)橙皮苷和黃芩苷可以在同一條件下被檢識[11-12]。本研究通過方法學(xué)驗證，建立用HPLC法同時測定清肺排毒湯凍干物中橙皮苷和黃芩苷2種黃酮類成分含量的方法，實驗結(jié)果表明該方法簡便、準(zhǔn)確可靠，可為清肺排毒湯成方制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Thermo Scientific UltiMate 3000高效液相色譜儀(ThermoFisher公司，包括四元梯度泵，WPS-3000SL自動進(jìn)樣器，TCC-3000RS柱溫箱，DAD-3000檢測器)；LGJ-10冷凍干燥機(jī)(四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展(北京)有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)； EX125ZH電子天平(奧豪斯儀器有限公司，感量0.01 mg)；FR124CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司，感量0.1 mg)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 橙皮苷對照品(批號：110721-201818，含量以96.2%計)，購自中國食品藥品檢定研究院，黃芩苷對照品(批號：wkq20010908，含量以98.7%計)，購自四川省維克奇生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，磷酸、甲醇等其他試劑均為分析純。

中藥飲片如下：麻黃飲片(批號：200601)、炙甘草飲片(批號：200601)、苦杏仁飲片(批號：200601)、生石膏飲片(批號：200501)、桂枝飲片(批號：200601)、澤瀉飲片(批號：200601)、豬苓飲片(批號：200601)、白術(shù)飲片(批號：200601)、茯苓飲片(批號：200601)、柴胡飲片(批號：200701)、黃芩飲片(批號：200701)、姜半夏飲片(批號：200601)、生姜飲片(批號：200801)、紫菀飲片(批號：200601)、款冬花飲片(批號：200601)、射干飲片(批號：200601)、細(xì)辛飲片(批號：200601)、山藥飲片(批號：200601)、陳皮飲片(批號：200601)、廣藿香飲片(批號：200801)均購于江西匯仁堂藥品連鎖有限公司；枳實飲片(批號：200101)購于康美藥業(yè)股份有限公司。所有飲片均由丹東市市場監(jiān)管事務(wù)服務(wù)中心王鐵軍主任中藥師鑒定。

2 方法和結(jié)果

2.1 凍干物的制備 按清肺排毒湯處方：麻黃9 g，炙甘草6 g，苦杏仁9 g，生石膏30 g，桂枝9 g，澤瀉9 g，豬苓9 g，白術(shù)9 g，茯苓15 g，柴胡16 g，黃芩6 g，姜半夏9 g，生姜9 g，紫菀9 g，款冬花9 g，射干9 g，細(xì)辛6 g，山藥12 g，枳實6 g，陳皮6 g，廣藿香9 g[4]。稱取各飲片(共計211 g)，生石膏飲片加水240 mL先煎15 min，其余20 味加8 倍量水浸泡30 min，待生石膏煎煮好后，加入浸泡好的各飲片，煎煮30 min，用200 目不銹鋼篩網(wǎng)濾過，飲片再進(jìn)行第2 次煎煮，加6 倍量水，煎煮30 min，用200 目不銹鋼篩網(wǎng)濾過，合并2 次的藥液。將藥液采用減壓濃縮的方法進(jìn)行低溫濃縮，控制濃縮溫度不超過50 ℃，將水煎濾液體積濃縮至約400 mL。采用冷凍干燥的辦法進(jìn)行干燥，將濃縮液至放置到冷凍干燥機(jī)的干燥盤中，再放置到冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行冷凍干燥，得到清肺排毒湯凍干物。

重復(fù)上述的操作方法，共制備3批清肺排毒湯凍干物，批號分別編為2008001、2008002、2008003，質(zhì)量分別為41.68 g、42.07 g、41.71 g。

除黃芩外，按清肺排毒湯處方，稱取麻黃等20 味飲片，按上述制備方法制備，得到缺黃芩的陰性凍干物；除枳實和陳皮外，按清肺排毒湯處方，稱取麻黃等19 味飲片，按上述制備方法制備，得到缺枳實和陳皮的陰性凍干物。

2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液(20：80)，檢測波長為283 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 取橙皮苷、黃芩苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并制成含橙皮苷47.64 μg·mL-1、黃芩苷121.27 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取清肺排毒湯凍干物約0.5 g，置碾缽中研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，將錐形瓶密塞，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 KHz)45 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.3 陰性樣品溶液的制備 取缺黃芩的陰性凍干物，按2.3.2項下供試品溶液制備項下的方法進(jìn)行制備操作，制得缺黃芩的陰性樣品溶液；取缺枳實和陳皮的陰性凍干物，按2.3.2項下供試品溶液制備項下的方法進(jìn)行制備操作，制得缺枳實和陳皮的陰性樣品溶液。

1.橙皮苷；2.黃芩苷A.對照品;B.供試品;C.缺黃芩陰性樣品;D.缺枳實和陳皮陰性樣品圖1 HPLC圖

2.4 系統(tǒng)適用性試驗 按2.2項下的色譜條件，分別取對照溶液、供試品溶液、缺黃芩的陰性樣品溶液、以及缺枳實和陳皮的陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品色譜圖中，橙皮苷和黃芩苷2種成分與相鄰的色譜峰之間的分離度均大于1.5。理論塔板數(shù)按橙皮苷峰計算不低于5000。缺黃芩的陰性樣品、缺枳實和陳皮的陰性樣品對待測成分的測定均無干擾。如圖1所示。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1、3、5、8、10、20 μL按2.2項下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄橙皮苷和黃芩苷的峰面積，分別以對照品的進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程：橙皮苷Y=25.9060X+0.5677(r=0.9993)、黃芩苷Y=49.1870X+0.0170(r=0.9994)。結(jié)果表明，橙皮苷的進(jìn)樣量在0.04764～0.9528 μg，黃芩苷的進(jìn)樣量在0.1213～2.425 μg范圍內(nèi)與峰面積均有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 精密吸取2.3.1項下混合對照品溶液10 μL，按2.2項下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)行6 次的進(jìn)樣測定，記錄橙皮苷和黃芩苷的峰面積。按峰面積計算，橙皮苷的RSD為0.4%，黃芩苷峰的RSD為0.7%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批次的清肺排毒湯凍干物樣品(批號：2008003)，按2.3.2項下的方法制備供試品溶液6 份，按2.2項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄橙皮苷和黃芩苷的峰面積，分別計算兩待測目標(biāo)成分含量。結(jié)果橙皮苷和黃芩苷的平均含量分別為3.776 mg·g-1、12.67 mg·g-1，橙皮苷的RSD為1.0%，黃芩苷的RSD為1.0%，表明該含量測定方法的重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取清肺排毒湯凍干物同一份供試品溶液(臨用新配)，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h，按2.2項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄橙皮苷和黃芩苷的峰面積，根據(jù)峰面積考察樣品溶液的穩(wěn)定性。計算得橙皮苷峰面積的RSD為1.0%，黃芩苷峰面積的RSD為0.7%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗 取同一批次已知含量的清肺排毒湯凍干物樣品(批號：2008003)適量，研細(xì)，取6 份，每份約0.25 g，精密稱定，根據(jù)清肺排毒湯凍干物樣品中橙皮苷和黃芩苷的含量按1∶1的比例添加橙皮苷和黃芩苷對照品，按2.3.2項下的方法進(jìn)行制備操作，按2.2項下的色譜條件進(jìn)行測定，計算兩待測成分的加樣回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果表明本含量測定方法具有良好的回收率。

表1 清肺排毒湯凍干物加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

2.10 樣品含量測定 取清肺排毒湯凍干物3批樣品適量，置碾缽中研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，按2.3.2項下的方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄橙皮苷和黃芩苷的峰面積，分別計算兩待測目標(biāo)成分含量，結(jié)果見表2。

表2 3批清肺排毒湯凍干物樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 凍干物的制備 清肺排毒湯為傳統(tǒng)湯劑，但水煎液體積大、有效成分濃度低、不易保存，且多為懸濁液，難以保證均勻取樣，不利于開展實驗。將水煎液適當(dāng)?shù)蜏販p壓濃縮，再通過冷凍干燥方法，將清肺排毒湯浸膏制成質(zhì)量穩(wěn)定、均一、易于溶解且無輔料添加的凍干物，且可使清肺排毒湯有效成分的分解和損失最小，從而提高后續(xù)研究的效率和質(zhì)量，為清肺排毒湯成方制劑的開發(fā)提供借鑒。

3.2 檢測波長的選擇 在190～400 nm范圍對橙皮苷和黃芩苷進(jìn)行紫外掃描，得到橙皮苷的最大吸收波長為283 nm，黃芩苷的最大吸收波長為277 nm。樣品中橙皮苷的含量相對低，為了提高對橙皮苷的檢測靈敏度，實驗選用283 nm作為檢測波長。在該波長下，2種黃酮類成分色譜峰形較好，檢測靈敏度均能達(dá)到測定要求。

3.3 提取條件考察 在固定超聲提取60 min的條件下，對提取溶劑進(jìn)行比對，分別采用30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇作為提取溶劑，以清肺排毒湯凍干物中橙皮苷、黃芩苷的綜合提取率為指標(biāo)，結(jié)果以70%甲醇作為提取溶劑對橙皮苷、黃芩苷2種成分提取效果最佳。仍以清肺排毒湯凍干物中橙皮苷、黃芩苷的綜合提取率為指標(biāo)，對超聲處理和加熱回流兩種提取方式進(jìn)行比對試驗，以超聲提取對2種成分的提取效果為佳。最后對15、30、45和60 min四個提取時間進(jìn)行比對試驗，結(jié)果超聲45 min和60 min接近，為節(jié)省提取時間，最終選擇超聲45min。

3.4 流動相考察 實驗中比較了甲醇-磷酸和乙腈-磷酸兩種流動相系統(tǒng)，在乙腈-磷酸系統(tǒng)下橙皮苷和黃芩苷獲得了更好的峰形和分離效果，最終確定以乙腈-0.2%磷酸溶液(20:80)為流動相。

3.5 耐用性考察 實驗中考察了方法的耐用性：比較不同的色譜柱(Agilent ZORBAX SB C18、Capcell Pak C18、Thermo Scientific Syncronis C18)，結(jié)果供試品在3種色譜柱上均能得到較好的分離；考察柱溫(20 ℃、25 ℃、30 ℃)對色譜分離的影響，結(jié)果表明柱溫對本測定方法中兩種成分的分離效果有較大的影響，柱溫在30 ℃時兩種成分與其前后峰的分離效果最佳，建議將柱溫控制在30 ℃。

3.6 后續(xù)研究工作的探索 質(zhì)量控制是開展中藥及復(fù)方研究工作的首要問題[13-14]。本實驗建立的同時測定清肺排毒湯凍干物中橙皮苷和黃芩苷2種黃酮類成分的含量測定方法，可為清肺排毒湯質(zhì)量研究提供借鑒，為清肺排毒湯后續(xù)的成方制劑開發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。清肺排毒湯藥味較多，化學(xué)成分復(fù)雜，除黃酮類成分外，還有生物堿等其他化學(xué)成分，對清肺排毒湯方中其它藥味進(jìn)行質(zhì)量控制的研究可進(jìn)一步深入。