陳妙佳， 馬思明， 李 洋， 賀 芬， 彭俊梅， 唐國(guó)濤， 曹 軒

(南華大學(xué)藥物藥理研究所 湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南省衡陽(yáng)市421001)

丹酚酸A是從丹參中分離得到的酚酸類化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化活性[1-2]。研究表明，丹酚酸A有望成為一種新的心腦血管保護(hù)劑[3-4]。但是丹酚酸A具備雙鍵、酯基、手性等復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，合成難度很大。由于丹酚酸A在丹參中的含量很小，如果直接從丹參中提取和純化，步驟復(fù)雜且產(chǎn)率很低。因此，丹酚酸A的原料來(lái)源有限且價(jià)格昂貴，限制了其進(jìn)一步研究[5-6]。因此合成丹酚酸A的結(jié)構(gòu)類似物對(duì)研究丹酚酸A類化合物的結(jié)構(gòu)以及藥理活性具備重要的理論價(jià)值[7-8]。

本文擬設(shè)計(jì)全新的丹酚酸A的類似物，結(jié)構(gòu)改造如下：①采用碳氮雙鍵或碳氮單鍵替代丹酚酸A中的酯鍵，提高化合物的穩(wěn)定性；②將其羧酸基團(tuán)酯化，提高其脂溶性；③用廉價(jià)易得的卡比多巴取代丹酚酸A中的酚酸類結(jié)構(gòu)片段；④用抗氧化能力更強(qiáng)的白藜蘆醇為結(jié)構(gòu)單元取代丹酚酸A結(jié)構(gòu)中的二苯乙烯片段[9-10]。通過(guò)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)體外模型法對(duì)所合成的丹酚酸A類似物進(jìn)行體外抗氧化活性的測(cè)定，為丹酚酸A類似物的研究提供合成思路和活性研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法1.1 試劑與檢測(cè)

卡比多巴、白藜蘆醇及硼氫化鈉均購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；DPPH購(gòu)自百靈威試劑有限公司；其他有機(jī)溶劑均購(gòu)自湖南匯虹試劑有限公司。除三氯氧磷在使用前進(jìn)行重蒸外，其他試劑一般并未做進(jìn)一步處理。1HNMR由湖南大學(xué)化學(xué)傳感國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和提供。

1.2 白藜蘆醛的合成

將3.0 g白藜蘆醇加入三口燒瓶中，加入15 mL N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，DMF)，磁力攪拌使其溶解。另加30 mL DMF于燒杯中，在通風(fēng)櫥內(nèi)緩慢滴入8 mL三氯氧磷(phosphorus oxychloride，POCl3)，小心攪拌，溶液由無(wú)色變成淡棕色。室溫下上述反應(yīng)液放置于恒壓滴液漏斗中趁熱滴入三口燒瓶中，攪拌2～3 h直至整個(gè)溶液變成凝膠狀固體。冰浴下，將120 mL水逐滴加入三口燒瓶，必要時(shí)采用機(jī)械攪拌過(guò)夜。有大量黃色固體析出，產(chǎn)物收率92%。

1.3 卡比多巴的酯化

將4.0 g卡比多巴加入150 mL三口燒瓶中。加入50 mL甲醇溶液。通入干燥濃鹽酸并加熱攪拌，回流2.5～6.0 h。同時(shí)用薄層色譜(Thin Layer Chromatography，TLC)確定反應(yīng)終點(diǎn)(水∶丙酮=1∶20)。反應(yīng)結(jié)束后將液體倒進(jìn)梨形燒瓶，減壓去除產(chǎn)物中的HCl氣體和溶劑，得到卡比多巴酯化粗產(chǎn)物。

1.4 丹酚酸A類似物a、b、c的合成

在燒瓶中加入500 mg白藜蘆醛和50 mL甲醇溶液，加入1 mL卡比多巴酯化產(chǎn)物，于65 ℃回流3 h。同時(shí)用監(jiān)測(cè)反應(yīng)(乙酸乙酯∶石油醚=1∶3)。將溶劑蒸發(fā)后，硅膠柱純化產(chǎn)物(洗脫劑甲醇∶二氯甲烷=1∶30)，得到丹酚酸A類似物a、b、c。

產(chǎn)物a熔點(diǎn)：134～135 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)：δ8.50(s,1H),7.51-7.41(m,2H),7.31(d,J=16.0 Hz,1H),6.90(d,J=16.0 Hz,1H),6.82(dd,J=8.0 Hz,2H),6.71(d,J=8.0 Hz,1H),6.68-6.60(m,1H),6.57(d,J=2.4 Hz,1H),6.52(dd,J=8.0 Hz,1H),6.26(d,J=2.4 Hz,1H),3.72(d,J=2.4 Hz,3H),3.01(dd,J=16.0 Hz,2H),1.44(s,3H)，產(chǎn)物收率35.8%。

產(chǎn)物b熔點(diǎn)：134～136 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)：δ8.52(d,J=4.0 Hz,1H),7.51-7.42(m,2H),7.32(d,J=16.0 Hz,1H),6.91(d,J=16.0 Hz,1H),6.88-6.79(m,2H),6.74-6.69(m,1H),6.67(d,J=2.4 Hz,1H),6.58(d,J=2.4 Hz,1H),6.54(dd,J=8.0 Hz,1H),6.27(d,J=2.4 Hz,1H),4.18(q,J=8.0 Hz,2H),3.04-2.92(m,2H),1.44(s,3H),1.24(dd,J=8.0 Hz,3H)，產(chǎn)物收率18.0%。

產(chǎn)物c熔點(diǎn)：136～138 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.51(s,1H),7.50-7.42(m,2H),7.31(d,J=16.0 Hz,1H),6.90(d,J=16.0 Hz,1H),6.86-6.77(m,2H),6.71(d,J=8.0 Hz,1H),6.60-6.49(m,2H),6.25(d,J=2.4 Hz,1H),3.05-2.88(m,2H),1.42(s,3H),1.28-1.21(m,3H),1.18(d,J=8.0 Hz,3H)，產(chǎn)物收率13.8%。

1.5 丹酚酸A類似物d、e、f的合成

在燒瓶中加入甲醇20 mL和8.8 mg丹酚酸A類似物a～c，再加入約3倍的硼氫化鈉，攪拌大約20 min。加水20 mL并調(diào)節(jié)pH為微酸性(約為6)后用乙酸乙酯(30 mL×3)萃取。用無(wú)水硫酸鈉干燥,旋干所得液體。得到丹酚酸A類似物d、e、f。

產(chǎn)物d熔點(diǎn)：170～173 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.48(s,1H),7.45(d,J=8.0 Hz,2H),7.30(d,J=16.0 Hz,1H),6.89(d,J=16.0 Hz,1H),6.81(d,J=8.0 Hz,3H),6.24(s,1H),3.71(d,J=4.0 Hz,3H),2.98(dd,J=16.0 Hz,2H),1.44(d,J=12.0 Hz,3H)，產(chǎn)物收率92%。

產(chǎn)物e熔點(diǎn)：172～174 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.51(s,1H),7.46(d,J=8.0 Hz,2H),7.31(d,J=16.0 Hz,1H),6.90(d,J=16.0 Hz,1H),6.87-6.75(m,3H),6.75-6.62(m,2H),6.61-6.44(m,2H),6.25(d,J=2.4 Hz,1H),4.18(q,J=8.0 Hz,2H),3.35(p,J=2.4 Hz,3H),2.98(q,J=12.0 Hz,2H),1.43(s,3H)，產(chǎn)物收率89%。

產(chǎn)物f熔點(diǎn)：175～178 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.56(d,J=4.0 Hz,1H),7.51(d,J=8.0 Hz,2H),7.37(d,J=16.0 Hz,1H),6.96(d,J=16.0 Hz,1H),6.88(d,J=8.0 Hz,3H),6.75(dt,J=8.0 Hz,2H),6.6-6.53(m,3H),6.31(d,J=2.4 Hz,1H),4.19(q,J=8.0 Hz,1H),3.01(q,J=12.0 Hz,2H),2.10(d,J=4.0 Hz,1H),1.46(d,J=4.0 Hz,3H),1.29(d,J=8.0 Hz,3H),1.23(d,J=8.0 Hz,3H)，產(chǎn)物收率90%。

1.6 DPPH法測(cè)定抗氧化活性

DPPH儲(chǔ)備液的制備：稱取5 mg DPPH試劑，加少量的無(wú)水乙醇溶解，得到紫色液體，并且將其定量轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度線；然后用移液管吸取2 mL試液置于100 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度線，搖勻得到DPPH儲(chǔ)備液，放到4 ℃冰箱中冷藏備用。待測(cè)樣品的制備：稱取1 mg丹酚酸A類似物a～f，用少量的無(wú)水乙醇使其溶解，并定量轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度線。隨后用移液管在10 mL容量瓶中準(zhǔn)確吸取1 mL試液置于100 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，搖勻，得到待測(cè)樣品a。再用上述方法分別制得待測(cè)樣品b～f。對(duì)照品的制備：用移液管吸取4 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)液放入10 mL的容量瓶中，隨后加乙醇定容至刻度線。

1.7 DPPH清除率的測(cè)定

在10 mL容量瓶中，先加入4.0 mL的DPPH溶液，隨后加入4.0 mL的待測(cè)試液，再用無(wú)水乙醇定容至刻度線，搖勻。立即用待測(cè)液將1 cm比色皿潤(rùn)洗，之后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)其光密度值(OD1)，再在室溫避光保存30 min后測(cè)光密度值(OD2)。對(duì)照試驗(yàn)為只加4.0 mL DPPH的乙醇溶液，測(cè)其光密度值(OD3)。同理，用上述方法分別測(cè)定其他待測(cè)樣品的光密度值(OD)。重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值作為最后結(jié)果。將所測(cè)得的清除率與維生素C標(biāo)準(zhǔn)品的清除率比較。按下式計(jì)算自由基清除率K(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD1-實(shí)驗(yàn)組OD2)/空白組OD3×100%。

2 結(jié) 果

2.1 丹酚酸A類似物的合成

丹酚酸A類似物的合成如圖1所示。在白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)中采用Vilsmeier-Haack反應(yīng)引入醛基，再將卡比多巴的羧酸基團(tuán)酯化。最后，將酯化產(chǎn)物與白藜蘆醛進(jìn)行醛胺縮合即得丹酚酸A類似物a、b、c?？紤]到碳氮雙鍵有可能不穩(wěn)定，將碳氮雙鍵還原為碳氮單鍵，最終獲得丹酚酸A類似物d、e、f。

圖1 化合物a-f的合成路線

2.2 DPPH法測(cè)定丹酚酸A類似物的抗氧化活性

丹酚酸A類似物d、e、f均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化活性，而丹酚酸A類似物a、b、c抗氧化活性很差(圖2)，可能是由于在水中容易分解導(dǎo)致的。經(jīng)過(guò)硼氫化鈉的還原后，碳氮雙鍵轉(zhuǎn)變?yōu)樘嫉獑捂I，提高了化合物的穩(wěn)定性，其抗氧化活性相差4倍以上。此外，丹酚酸A類似物d、e、f的抗氧化活性明顯強(qiáng)于對(duì)照品抗壞血酸以及丹酚酸A。

圖2 DPPH法測(cè)定丹酚酸A類似物的自由基清除率

3 討 論

丹酚酸A的結(jié)構(gòu)可視為酚酸類化合物與二苯乙烯類化合物兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元的酯化反應(yīng)產(chǎn)物。由于丹酚酸A的結(jié)構(gòu)中具備不穩(wěn)定的酯鍵，在體內(nèi)容易水解開環(huán)，而且由于其中含有羧酸基團(tuán)，使得其分子的穿膜能力大大下降，使得其很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮其藥理作用。如果采用酰肼鍵替代丹酚酸A中的酯鍵，可進(jìn)一步穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，此外若將其羧酸基團(tuán)酯化，可提高其脂溶性，增加其穿膜能力，增強(qiáng)其藥效。丹酚酸A的結(jié)構(gòu)中的二苯乙烯結(jié)構(gòu)中為茋四酚結(jié)構(gòu)，具有4個(gè)羥基，從而具備較好的清除自由基能力。但類似結(jié)構(gòu)的白藜蘆醇具備茋三酚結(jié)構(gòu)，其抗氧化能力更強(qiáng)。白藜蘆醇是一種天然多酚類物質(zhì)，生理活性很多[11-13]，其抗氧化能力在多酚類中是較強(qiáng)的，可以用來(lái)預(yù)防冠心病，保護(hù)心血管[14-15]。研究表明，其抗氧化能力的重要基團(tuán)是4′-羥基，使得其抗心血管氧化能力提升，類似的結(jié)構(gòu)還有紫檀茋等，因此如果采用茋三酚的結(jié)構(gòu)片段替代丹酚酸A結(jié)構(gòu)片段中的茋四酚結(jié)構(gòu)，有可能獲得更強(qiáng)抗氧化活性的丹酚酸A類似物[16]。

經(jīng)過(guò)Vilsemier反應(yīng)在其芳環(huán)上引入醛基，是目前在芳環(huán)上引入甲酰基的常用方法。其反應(yīng)機(jī)理為DMF與三氯氧磷反應(yīng)，產(chǎn)生親電的N+，隨后N+進(jìn)攻白藜蘆醇中含有兩個(gè)羥基的苯環(huán)的鄰位，即苯環(huán)上的2位碳，經(jīng)水解、氧化得到目標(biāo)產(chǎn)物白藜蘆醛。實(shí)驗(yàn)采用DMF作溶劑的情況下，只需常溫就可以反應(yīng)，不但產(chǎn)物收率較高，而且直接加水后產(chǎn)物析出呈現(xiàn)亮黃色，一般無(wú)需純化即可投入下一步使用。

卡比多巴的酯化過(guò)程需要在反應(yīng)過(guò)程中通入濃鹽酸來(lái)催化反應(yīng)，因?yàn)長(zhǎng)-甲基多巴不溶于甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇，也有采用惰性溶劑中添加催化量的SOCl2等鹵化劑來(lái)催化反應(yīng)，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)添加SOCl2反應(yīng)時(shí)間需要1～2天，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中采用通入干燥的HCl氣體回流反應(yīng)，3～5 h就可反應(yīng)完全。

醛胺縮合反應(yīng)可直接在醇溶液條件下加熱回流3 h。由于產(chǎn)物a、b、c的結(jié)構(gòu)中碳氮雙鍵只連有一端芳香環(huán)，使得整個(gè)的N上負(fù)電共軛較差，從而導(dǎo)致縮合產(chǎn)物很容易水解，在柱層析時(shí)大部分會(huì)分解。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，直接在反應(yīng)后體系中加入硼氫化鈉進(jìn)行還原，之后再進(jìn)行柱層析，產(chǎn)物收率顯著提高。

綜上，本文所設(shè)計(jì)的丹酚酸A類似物d、e、f均具有很強(qiáng)的抗氧化活性，強(qiáng)于對(duì)照品抗壞血酸以及丹酚酸A。推測(cè)活性提升極有可能是由于采用了白藜蘆醇茋三酚的結(jié)構(gòu)片段替代丹酚酸A結(jié)構(gòu)片段中的茋四酚結(jié)構(gòu)。這說(shuō)明所設(shè)計(jì)的丹酚酸A類似物具備進(jìn)一步研究和開發(fā)的潛力，為丹酚酸類化合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與藥理作用提供基礎(chǔ)。