吳冰璇， 黃淑芬， 吳文超， 黃小鳳， 詹 紅

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，廣東省廣州市 510080)

急性心肌梗死是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致心源性猝死和殘疾的主要原因之一，溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)是臨床廣泛使用且最有效的治療措施，能盡快恢復(fù)缺血區(qū)域血流，減少急性心肌缺血性損傷、縮小心肌梗死范圍。在心肌缺血再灌注過(guò)程中可能因多種原因?qū)е滦募≡俟嘧p傷而進(jìn)一步加劇缺血心肌細(xì)胞的死亡，誘發(fā)其他致死性損傷[1]。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在調(diào)節(jié)心血管功能方面起著至關(guān)重要的作用，由腎臟分泌的腎素能夠催化血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ，是RAAS系統(tǒng)的主要限速步驟[2-3]。阿利吉侖，作為一種新型的非肽類(lèi)口服腎素抑制劑，能夠直接抑制血漿腎素活性及其對(duì)血管緊張素原的酶促作用，從源頭上阻斷RAAS系統(tǒng)。阿利吉侖能夠抑制炎癥，防止動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成，并且能夠改善心肌梗死后的心室重構(gòu)[4]，且能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激級(jí)聯(lián)反應(yīng)改善高血壓大鼠的心肌缺血再灌注損傷[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，阿利吉侖可通過(guò)抑制線(xiàn)粒體介導(dǎo)的凋亡通路而改善損傷[6]。本文探討小鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，阿利吉侖是否通過(guò)調(diào)控相關(guān)凋亡因子及抑制缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)，減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷，促進(jìn)其心功能恢復(fù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

阿利吉侖購(gòu)買(mǎi)于APExBio公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、ELISA試劑盒購(gòu)自依科賽生物科技有限公司；PCR引物購(gòu)自廣州剪刀手公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購(gòu)于EZBioscience公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；B淋巴細(xì)胞2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)一抗購(gòu)于Cell Signaling Technology公司。主要儀器包括：高通量組織研磨儀(TissueLyser II，QIAGEN GmbH，德國(guó))、酶標(biāo)儀(Sunrise，TECAN，奧地利)、小動(dòng)物呼吸機(jī)(HX-101E，成都泰盟公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

24只8～10周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量23～28 g，購(gòu)于江蘇集萃藥康生物有限公司，許可證編號(hào)為SCXK(蘇)2018-0008。將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、低劑量組、高劑量組，每組6只。假手術(shù)組和模型組予等量0.9%生理鹽水灌胃處理，低劑量組和高劑量組分別給予小鼠阿利吉侖25、50 μg/g灌胃處理，每日1次，連續(xù)給藥7天。

1.3 心肌缺血再灌注損傷模型的建立

連續(xù)給藥7天后，予模型組、低劑量組和高劑量組小鼠手術(shù)造模。經(jīng)小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液(50 μg/g)，氣管切開(kāi)插管后連接呼吸機(jī)，設(shè)置參數(shù)：頻率120次/min，呼吸比5∶4；潮氣量1 mL。胸骨左旁斜行切口，于第4肋間暴露小鼠心臟；定位左心耳下方約2 mm處用7-0絲線(xiàn)結(jié)扎左前降支，缺血30 min后松開(kāi)結(jié)扎線(xiàn)，恢復(fù)再灌注后以6-0絲線(xiàn)關(guān)閉胸腔。小鼠恢復(fù)自主呼吸后拔管，6-0絲線(xiàn)縫合氣管，4-0絲線(xiàn)縫合皮膚，置于電熱毯保溫待蘇醒。假手術(shù)組僅做開(kāi)胸處理，不予結(jié)扎左前降支。24 h后采集左心室心肌組織樣本做后續(xù)檢測(cè)。

1.4 小鼠超聲心動(dòng)圖

小鼠心肌缺血30 min，再灌注24 h后通過(guò)超聲心動(dòng)圖系統(tǒng)(Visual Sonics Vevo 2100,VisualSonics,加拿大)評(píng)估心功能。小鼠吸入異氟醚麻醉(0.5%～1.0%)，使用MX400D探頭通過(guò)二維M模式在左心室長(zhǎng)軸切面下追蹤其平均連續(xù)5個(gè)心動(dòng)周期，通過(guò)Vevo成像測(cè)量舒張期末左心室內(nèi)徑和收縮期末左心室內(nèi)徑，計(jì)算得到收縮期末左心室前壁厚度(left ventricular anterior wall end-systolic dimension，LVAWs)、收縮期末左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall end-systolic dimension，LVPWs)、舒張期末左心室前壁厚度(LVAW-diastolic dimension，LVAWd)、舒張期末左心室后壁厚度(LVPW-diastolic dimension，LVPWd)、每搏輸出量、左心室射血分?jǐn)?shù)、左心室短軸縮短率。

1.5 ELISA檢測(cè)IL-6及TNF-α

使用高通量組織研磨儀制備10%左心室心肌組織勻漿，將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入孔中(100 μL/孔)并封板，室溫下孵育90 min后洗板；加入生物素化抗體孵育60 min，洗板后加入酶結(jié)合物避光孵育30 min；再次洗板并加入顯色底物，避光孵育15 min終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值，計(jì)算得出樣品的炎癥因子濃度。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)

使用TRIZOL法提取左心室部位心肌組織總RNA：加入1 mL TRIZOL研磨至不見(jiàn)組織碎塊。加入200 μL氯仿，震蕩15 s后離心，4 ℃，10 000 g，15 min。將最上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的EP管中，加入500 μL異丙醇，離心后的RNA沉淀經(jīng)75%乙醇洗滌并干燥后，加入無(wú)RNA酶水重懸。按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，42 ℃反應(yīng)15 min，95 ℃反應(yīng)15 s。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(CFX96 Touch，BioRad，美國(guó))擴(kuò)增目的基因cDNA，擴(kuò)增引物序列為：Bax上游引物5′-TGCGTCCACCAAGAAGC-3′，Bax下游引物5′-CCACCCGGAAGA AGACC-3′；Bcl-2上游引物5′-ACAAGTGCCTGCTTTATGG-3′，Bcl-2下游引物5′-CTGCTCTGTTCCAAACCC-3′；GAPDH上游引物5′-GGATGCTGCCCTTACCC-3′，GAPDH下游引物5′-GTTCACACCGACCTTCACC-3′。擴(kuò)增程序設(shè)置為解鏈95 ℃反應(yīng)10 s，退火60 ℃反應(yīng)30 s，循環(huán)40次；以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)定量表達(dá)量。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

使用RIPA裂解液提取心肌組織中的總蛋白后使用BCA法進(jìn)行定量，蛋白質(zhì)上樣于10%預(yù)制的SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜。5%BSA溶液室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗10～14 h，洗膜后室溫下孵育二抗1 h，使用化學(xué)發(fā)光儀(ChemiDoc XRS+，BioRad，美國(guó))曝光得到蛋白條帶，使用Image J系統(tǒng)分析條帶灰度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 成功建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型

模型建立過(guò)程中，結(jié)扎左前降支后肉眼可見(jiàn)左心室及心尖部心肌變白、心動(dòng)變緩，體溫下降，四肢及尾部循環(huán)末梢呈蒼白略透明狀；恢復(fù)再灌注后可見(jiàn)心肌及循環(huán)末梢血供重新充盈，心率增快且體溫回升。小鼠術(shù)后自主呼吸恢復(fù)良好，活動(dòng)受限但生命體征平穩(wěn)，小鼠心肌缺血再灌注損傷模型成功建立。

2.2 各組超聲心動(dòng)圖參數(shù)比較

與假手術(shù)組比較，其他組小鼠的每搏輸出量、心輸出量、LVAWs、LVPWs、LVPWd均顯著降低(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組的左心室射血分?jǐn)?shù)和左心室短軸縮短率顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)和左心室短軸縮短率明顯升高(P<0.05)，且隨著劑量的增加而呈濃度依賴(lài)性升高(P<0.05；表1)。

表1 各組小鼠心肌缺血再灌注24 h后超聲心動(dòng)圖參數(shù)比較(n=6)

2.3 阿利吉侖降低小鼠心肌缺血再灌注后炎癥因子水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，其他3組小鼠心肌組織的TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，低劑量組、高劑量組TNF-α和IL-6水平明顯降低(P<0.05)。與低劑量組比較，高劑量組TNF-α明顯降低(P<0.05；表2)。

表2 阿利吉侖對(duì)小鼠心肌缺血再灌注后炎癥因子的影響(n=3) 單位：ng/g

2.4 阿利吉侖抑制小鼠心肌缺血再灌注后凋亡水平

與假手術(shù)組比較，模型組的抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而促凋亡基因Bax的表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。使用阿利吉侖處理后，Bcl-2的表達(dá)量有所上升(P<0.05)，Bax則明顯下降(P<0.05；圖1)。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果一致(圖2)。

圖1 阿利吉侖對(duì)小鼠心肌缺血再灌注后心肌組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響(n=6)

圖2 阿利吉侖對(duì)小鼠心肌缺血再灌注后心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響(n=6)

3 討 論

近年來(lái)研究表明，預(yù)防性使用具有心臟保護(hù)功能的藥物能夠極大程度地避免心肌缺血再灌注損傷，盡可能地縮小梗死面積、保留心肌活性及維持心臟功能[7-8]。阿利吉侖作為新一代腎素直接抑制劑，具有生物利用度高、腎素專(zhuān)一性高、半衰期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。它與心臟、神經(jīng)和腎臟保護(hù)作用有關(guān)，且其抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用獨(dú)立于其降血壓活性[9]。Chen等[10]研究證明，阿利吉侖能降低心肌梗死標(biāo)記物水平、縮小梗死面積、顯著改善心臟功能。這與本研究阿利吉侖能提高心肌缺血再灌注后左心室射血分?jǐn)?shù)和左心室短軸縮短率的結(jié)果相一致，驗(yàn)證了阿利吉侖對(duì)缺血性心肌的保護(hù)功能。

本研究經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研[10-12]之后設(shè)定了25 μg/g和50 μg/g兩個(gè)給藥劑量，結(jié)果顯示高劑量組較低劑量組能進(jìn)一步改善心臟收縮功能，降低炎性因子TNF-α分泌水平。而在一項(xiàng)為期4周的臨床隨機(jī)雙盲研究中[13]，對(duì)236名輕度至中度高血壓患者進(jìn)行了不同劑量(37.5、75、150、300 mg/天)的阿利吉侖與氯沙坦(100 mg/天)的比較。結(jié)果顯示，阿利吉侖導(dǎo)致了明顯的劑量依賴(lài)性血漿腎素活性降低以及日間動(dòng)態(tài)收縮壓下降，而100 mg氯沙坦對(duì)日間收縮壓的影響與75、150和300 mg阿利吉侖無(wú)顯著差異。結(jié)果提示阿利吉侖存在一個(gè)最佳的劑量范圍，過(guò)高的劑量并不一定會(huì)帶來(lái)更佳的藥物效果，在不同病理生理過(guò)程中的藥理機(jī)制與更精確的劑量范圍還需進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究與臨床試驗(yàn)來(lái)確定。

心肌缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，主要包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、線(xiàn)粒體能量代謝障礙和細(xì)胞凋亡等相互作用的分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò)[14]。缺血再灌注過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)氫離子和鈣離子的積累以及線(xiàn)粒體膜電位的破壞會(huì)導(dǎo)致自由基或活性氧類(lèi)的形成?；钚匝醯姆e累除了激活氧化應(yīng)激反應(yīng)外，還直接損傷細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。這種非特異性損傷引發(fā)了細(xì)胞因子介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致各類(lèi)炎性因子的產(chǎn)生[15]。IL-6減少一氧化氮的生成，加重血管內(nèi)皮的損害[16]，且高水平的可溶性IL-6受體可以預(yù)測(cè)STEMI患者未來(lái)的心血管事件和死亡率[17]。過(guò)度的TNF-α表達(dá)則會(huì)引起心肌收縮功能障礙、心肌細(xì)胞肥大、纖維化和死亡。本研究結(jié)果提示阿利吉侖可能是通過(guò)抑制炎性反應(yīng)相關(guān)通路減少促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌以維持心肌細(xì)胞的活性。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序化死亡的主要模式，在組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的發(fā)展和維持中發(fā)揮著重要作用[18]。細(xì)胞凋亡可受TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的調(diào)控，Bcl-2家族促凋亡蛋白(Bax)和抗凋亡蛋白(Bcl-2)之間的平衡決定了細(xì)胞在受到一定刺激或損傷后存活或發(fā)生凋亡的可能性。本研究結(jié)果顯示，阿利吉侖能夠明顯上調(diào)小鼠心肌缺血再灌注后Bcl-2的水平，相應(yīng)地下調(diào)Bax的表達(dá)，為阿利吉侖對(duì)心臟保護(hù)的作用機(jī)制提供了凋亡相關(guān)的研究靶點(diǎn)及更進(jìn)一步的理論支持。

本研究尚存在一定的缺陷和不足。如實(shí)驗(yàn)中未能設(shè)置藥物梯度質(zhì)量濃度來(lái)探究最佳質(zhì)量濃度，且只檢測(cè)了心肌缺血再灌注24 h后急性期的左心室心肌組織樣本，更長(zhǎng)遠(yuǎn)預(yù)后的影響有待進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了阿利吉侖在心肌缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用，從減輕炎癥反應(yīng)、抑制凋亡通路兩個(gè)方向進(jìn)一步深入探討分子機(jī)制建立了良好的基礎(chǔ)，也為提高心肌活性，改善心臟功能，進(jìn)而減少缺血性心臟疾病患者不良事件的發(fā)生提供了可能的研究靶點(diǎn)。