何寶鳳， 雷俊悅， 曾 奎， 陳雄英， 黃秋林

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，湖南省衡陽(yáng)市 421001)

原發(fā)性肝癌是全球發(fā)病率第六位及癌癥相關(guān)死亡率第四位的癌癥[1]。Apelin在體內(nèi)分布廣泛，在右心房、左心室、腦、肺、肝和腎上腺中均可檢測(cè)到Apelin的表達(dá)，尤其在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)[2]。Apelin可通過(guò)旁分泌的形式介導(dǎo)腫瘤新生血管的生成，Picault等[3]報(bào)道了Apelin信號(hào)通過(guò)激活自分泌參與結(jié)腸腺癌的生長(zhǎng)。 Apelin家族包括多種亞型，焦谷氨酸修飾形式的Apelin-13是其中生物活性最強(qiáng)的一種。Apelin-13與部分腫瘤的生長(zhǎng)侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5]。Apelin在肝癌中表達(dá)上調(diào)，以自分泌的形式通過(guò)PI3K/Akt通路促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[6]。本研究以不同濃度Apelin-13處理肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞不同時(shí)間，觀察其對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，以研究其在肝癌發(fā)展中的影響及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所；Aeplin-13購(gòu)自Santa公司；抗-CyclinD1抗體、抗-Caspase-3抗體購(gòu)自ABZOOM公司；MTT試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠試劑盒購(gòu)自博士德生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌HepG2細(xì)胞37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察到約90%細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)板后，用胰酶消化并吹打成懸液。接種于96孔板中，約5×103/孔。待細(xì)胞覆蓋率約50%時(shí)，予細(xì)胞換液，加入不含10%FBS的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h備用。

1.3 細(xì)胞分組

根據(jù)本課題組前期的研究[7]，按不同濃度的Aeplin-13分為5組：10%FBS(對(duì)照組)、0.000 1、0.001、0.01、0.1 μmol/L組，處理時(shí)間為24 h；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。再根據(jù)初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用差異最大的Apelin-13濃度(0.1 μmol/L)處理不同時(shí)間：0 h(對(duì)照組)、6、12、18、24 h組。具體方法：將上述處理后的各組細(xì)胞加入0.1 mL含10%FBS的培養(yǎng)基，24 h組加入0.1 μmol/L Apelin-13，開(kāi)始計(jì)時(shí)，6 h后18 h組加入0.1 μmol/L Apelin-13，以此類(lèi)推，對(duì)照組不加入Apelin-13，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 MTT檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖

細(xì)胞分組后，每個(gè)孔各加入20 μL 0.5%MTT(5 g/L)，培養(yǎng)箱內(nèi)放置4 h，然后吸取丟棄原培養(yǎng)液加入150 μL DMSO，振蕩10 min后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)量各孔在490 nm處的吸光值。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞裂解30 min，4 ℃離心8 min(12 000 r/min)，收集上清液。采用BCA試劑盒進(jìn)行HepG2細(xì)胞蛋白定量，將蛋白量調(diào)制等量后，加入上樣緩沖液，加熱至99 ℃ 10 min，冷卻至4 ℃ 4 min，然后置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。將制備好?.0 mm厚度的10%SDS-PAGE凝膠置于電泳緩沖液中上樣(每孔20 μL蛋白樣品)，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后使用5%封閉液封閉2 h。封閉結(jié)束后，加入稀釋號(hào)的一抗孵育過(guò)夜(抗體效價(jià)為1∶250)，TBST洗膜3次，10 min/次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(抗體效價(jià)為1∶1 000)，搖床上孵育60 min，TBST洗膜3次，10 min/次。將增強(qiáng)劑、穩(wěn)定劑、背景抑制劑按照20∶20∶1的比例混合，加至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，孵育5 min后顯影。Mias圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各條帶灰度值,與β微管蛋白(β-Tubulin)條帶光密度值之比反映蛋白的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Apelin-13在不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，0.000 1、0.001、0.01、0.1 μmol/L組的OD值增加(P<0.05；圖1)，且OD值隨著Apelin-13濃度增加而增加，Apelin-13呈濃度依賴性促進(jìn)細(xì)胞增殖。用0.1 μmol/L Apelin-13處理HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后，OD值隨著Apelin-13處理時(shí)間的增加而增加(P<0.05；圖2)，Apelin-13呈時(shí)間依賴性促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖1 不同濃度Apelin-13對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

圖2 0.1 μmol/L的Apelin-13處理不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

2.2 不同濃度Apelin-13及不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞中CyclinD1表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，0.000 1、0.001、0.01、0.1 μmol/L組的CyclinD1表達(dá)升高，且隨濃度升高呈遞增趨勢(shì)(P<0.05；圖3)。用0.1 μmol/L的Apelin-13處理HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后，CyclinD1表達(dá)隨Apelin-13處理時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)(P<0.05；圖4)。

圖3 不同濃度Apelin-13對(duì)HepG2細(xì)胞中CyclinD1表達(dá)的影響

圖4 0.1 μmol/L Apelin-13處理不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞中CyclinD1表達(dá)的影響

2.3 不同濃度Apelin-13及不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，0.000 1、0.001、0.01、0.1 μmol/L組的Caspase-3表達(dá)降低，且Caspase-3表達(dá)隨濃度的增高而降低(P<0.05；圖5)。用0.1 μmol/L Apelin-13處理HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后，Caspase-3的表達(dá)隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而降低(P<0.05；圖6)。

圖5 不同濃度Apelin-13對(duì)HepG2細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)的影響

圖6 0.1 μmol/L Apelin-13處理不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)的影響

3 討 論

Apelin是從牛胃分泌物中提取的孤兒G蛋白偶聯(lián)受體的天然配體。Apelin/APJ在體內(nèi)分布廣泛，作為血管活性肽的Apelin以內(nèi)分泌、旁/自分泌等方式在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面的生物學(xué)效應(yīng)成為了研究熱點(diǎn)[8]。Apelin-13作為具有最高的生物學(xué)活性的Apelin亞型，參與了多種重要的生物學(xué)過(guò)程。Peng等[5]發(fā)現(xiàn)Apelin-13可通過(guò)ERK1/2/AIB1信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲。Apelin-13能促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖，同時(shí)通過(guò)PAK1-cofilin磷酸化機(jī)制介導(dǎo)了Apelin-13促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞遷移[4]。

筆者通過(guò)體外培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，研究不同濃度及不同作用時(shí)間的Apelin-13對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)隨著Apelin-13濃度增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞增殖能力增加，證實(shí)外源性Apelin-13可促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖，這與Chen等[9]在結(jié)腸癌中Apelin-13對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞作用結(jié)果一致。同時(shí)本文利用Western blot檢測(cè)Apelin-13作用下HepG2細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)水平。細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下由G1期進(jìn)入S期后，細(xì)胞內(nèi)的CyclinD1會(huì)迅速分解，一旦CyclinD1持續(xù)高表達(dá)，就會(huì)使細(xì)胞的G1期縮短，使細(xì)胞周期變化，提前進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，這也是腫瘤的發(fā)生機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示，隨著Apelin-13濃度升高和作用時(shí)間延長(zhǎng)，CyclinD1表達(dá)也隨之增高。Caspase-3是包括凋亡在內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程中的關(guān)鍵酶。本研究結(jié)果顯示，隨著Apelin-13濃度的增高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Caspase-3的表達(dá)也隨之降低，提示Apelin-13可呈濃度和時(shí)間依賴性抑制HepG2細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)，從蛋白水平進(jìn)一步證實(shí)其能抑制HepG2細(xì)胞凋亡。有研究表明，Caspase-3在肝癌組織中表達(dá)增高，并與肝癌細(xì)胞凋亡有關(guān)[10]。結(jié)合本研究結(jié)果，Apelin-13可能通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Lu等[11]發(fā)現(xiàn)Apelin-13可通過(guò)相應(yīng)的機(jī)制來(lái)促進(jìn)視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，并能抑制其凋亡。前期研究發(fā)現(xiàn)Apelin-13可通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路，上調(diào)HepG2細(xì)胞Beclin1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞自噬[7]，該機(jī)制是否與增殖和凋亡有關(guān)有待進(jìn)一步證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，Apelin-13是參與肝癌細(xì)胞增殖的新分子，且可抑制Caspase-3蛋白的表達(dá)，對(duì)探尋肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有重要意義，有望成為肝癌一個(gè)新的分子治療靶點(diǎn)。