肖琳琳， 吳曉玲， 鄭鑫鎣， 唐康喜， 彭棟梁， 劉 鑫

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，湖南省衡陽市 421001；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南省長沙市 410000；3.啟迪古漢集團衡陽中藥有限公司，湖南省衡陽市 421001；4.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，湖南省衡陽市 421001)

支氣管哮喘(Bronchial asthma，BA)是一種慢性氣道炎癥性疾病，其表現(xiàn)以氣道炎癥、組織重塑、氣道高反應(yīng)性為主，治療以糖皮質(zhì)激素為主,但后期不良反應(yīng)大，氣道重塑病理改變嚴重，且氣道重塑被認為是其常規(guī)治療后期會出現(xiàn)藥物敏感性降低甚至抵抗的重要原因。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在哮喘氣道重塑中發(fā)揮重要作用，TGF-β1能增加膠原及蛋白沉積，促進上皮纖維化及肌成纖維細胞的增殖，導(dǎo)致氣道的重塑[2]，且與疾病的嚴重程度成正相關(guān)[3]。自噬是指自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ATG)調(diào)控下的一種細胞自我保護機制。自噬的上調(diào)伴隨著TGF-β1的高分泌，可通過TGF-β1介導(dǎo)哮喘的氣道重塑[4]。P62蛋白是細胞自噬的標志蛋白[5]。高P62水平能減少自噬作用，維持細胞生長平衡的穩(wěn)態(tài)[6]。在病理條件下，Nrf2的活性能被P62影響[7]，而后激活抗氧化反應(yīng)，減少哮喘氣道炎癥及重塑。

細胞自噬可能是調(diào)節(jié)人體陰陽平衡的微觀基礎(chǔ)[8]。哮喘的發(fā)生與肺、脾、腎三臟密切相關(guān)，而腎陽虛是哮病中晚期階段的主要病理機制[9]。古漢養(yǎng)生精具有溫腎益精的作用，常用于腎精不足所致頭暈、心悸、耳鳴、哮喘、健忘、失眠、疲乏無力等多種疾病。吳瓊等[10]提示補腎類中藥具有陰陽調(diào)和作用，起效原因可能是通過干預(yù)細胞自噬的信號通路。本文通過實驗探討古漢養(yǎng)生精是否可以通過調(diào)節(jié)P62、TGF-β1的表達，從而減輕腎陽虛哮喘大鼠的氣道重塑。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑

Wistar大鼠購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(湘)2014-0011。卵蛋白(ovalbumin，OVA)購于Sigma公司；氫氧化鋁干粉[Al(OH)3]購于天津福晨化學(xué)試劑有限公司；古漢養(yǎng)生精購于啟迪古漢集團衡陽中藥有限公司；氫化潑尼松龍注射液購于華中藥業(yè)股份有限公司；P62多克隆抗體購于Eptitomics公司；GAPDH多克隆抗體購于杭州賢至公司。

1.2 動物分組和腎陽虛哮喘大鼠模型的建立

參照文獻[11]將30只4周齡體質(zhì)量(120±10) g的健康清潔級Wistar雄性大鼠，隨機分成正常組、哮喘組、腎陽虛哮喘組、古漢養(yǎng)生精低、中、高劑量組，每組5只。正常組每日每只予生理鹽水10 mg肌注，其余各組大鼠每日每只予氫化可的松注射液10 mg肌注，連續(xù)12天。根據(jù)國家衛(wèi)生部《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》[12]。在第13、20天，腎陽虛哮喘組及古漢養(yǎng)生精低、中、高劑量組大鼠腹腔注射0.1 mL混合液[OVA 1 mg+Al(OH)3100 mg+生理鹽水]至致敏。第27天，自制密閉霧化容器，將致敏的大鼠單獨放入其中進行霧化，霧化液為1% OVA，每次時間為30 min，隔天霧化1次(共7次)引起哮喘發(fā)作。正常組腹腔注射0.1 mL生理鹽水致敏，使用蒸餾水進行霧化吸入作為對照。古漢養(yǎng)生精低、中、高劑量組每次霧化激發(fā)前30 min對各組行相應(yīng)劑量的古漢養(yǎng)生精(4×10-3、8×10-3、1.6×10-2mL/g)灌胃。

1.3 肺組織標本制備

在大鼠末次霧化激發(fā)24 h后，將大鼠麻醉，通過腹腔注射1 mL 10%水合氯醛，挑破腹主動脈，將大鼠血放干，剪開胸腔，切取左肺一部分組織保存于-80 ℃的冰箱中，進行qRT-PCR檢測。右側(cè)支氣管被注入4%中性甲醛，觀察肺葉膨脹變白后再切取一部分肺組織，行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色及免疫組化檢測。

1.4 肺組織病理改變的檢測

取固定好的肺組織，根據(jù)常規(guī)病理學(xué)方法，進行脫水、包埋、切片、HE染色，中性樹膠封片后顯微鏡觀察。

1.5 氣道重塑指標的測定

參照文獻[2]，將肺組織HE染色切片，在顯微鏡下放大200倍，按隨機數(shù)字法，每張玻片選取3個完整中小支氣管[500 μm<支氣管基底膜周徑<1 500 μm]，應(yīng)用圖像采集系統(tǒng)軟件，以Image-proplus圖像分析軟件測量支氣管基底膜周徑(basement membrane perimeter，Pbm)、支氣管管壁面積(wall area of bronchial tube，Wat)、支氣管內(nèi)壁面積(wall area of bronchial interior，Wai)、支氣管管壁平滑肌面積(wall area of bronchial smooth muscle，Wam)，然后將測得的結(jié)果使用Pbm進行標化，分別以Wat/Pbm、Wai/Pbm、Wam/Pbm表示，記錄所測值。

1.6 Western blot檢測肺組織P62蛋白表達

將肺組織按比例加入裂解液，提取總蛋白，測定蛋白水平。按BCA蛋白定量試劑盒說明書進行定量，將提取的總蛋白取出，配置凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，用化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。

1.7 qRT-PCR檢測肺組織TGF-β1 mRNA表達

選取肺組織0.1 g左右，通過液氮將其研磨成粉末，將1 mL Trizol加入其中，按照試劑盒說明書提取總RNA，進行RNA反轉(zhuǎn)錄。內(nèi)參設(shè)計引物序列為18SsrRNA。使用熒光染料SYBR Green I方法，其反應(yīng)物的組成為：正向引物、反向引物各0.5 μL，AceQTM qPCR SYBR? Green Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL(cDNA稀釋10倍)，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序通過ViiA 7T System software軟件設(shè)定，95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s，45個循環(huán)。各個基因的Ct值通過Applied Biosystems ViiA 7TM Real-Time PCR System檢測，所有反應(yīng)均設(shè)3個復(fù)孔。Comparative Delta-delta Ct法計算△△Ct，采用2-△△CT計算各個基因相對于正常組的表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果2.1 腎陽虛哮喘大鼠模型的建立

腎陽虛哮喘大鼠出現(xiàn)了無光澤的皮毛、飲水量增多、大小便量增加，身體出現(xiàn)消瘦及動作遲緩，精神較差及蜷縮拱背癥狀；致敏原激發(fā)后哮喘組、腎陽虛哮喘組出現(xiàn)呼吸深快或點頭呼吸，或口、鼻、四肢紫紺，提示各組大鼠造模成功。

2.2 各組大鼠肺組織病理改變的比較

正常組大鼠無明顯炎性細胞浸潤，支氣管黏膜結(jié)構(gòu)完整,肺泡無擴張。許多炎性細胞浸潤于哮喘組支氣管黏膜和支氣管壁的周圍，支氣管中的管壁和基底膜層變厚，上皮細胞出現(xiàn)壞死及脫落，同時伴有黏膜充血腫脹和平滑肌變厚。腎陽虛哮喘組病理改變較哮喘組明顯，且可見支氣管管壁塌陷變形。各劑量組大鼠較腎陽虛哮喘組上述改變明顯減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠肺組織病理結(jié)果(HE染色，200×)

2.3 各組大鼠氣道重塑指標的比較

與正常組比較，哮喘組及腎陽虛哮喘組Wat/Pbm、Wai/Pbm、Wam/Pbm值上升且腎陽虛哮喘組上升更明顯(P<0.05)；古漢養(yǎng)生精低、中、高劑量組Wat/Pbm、Wai/Pbm、Wam/Pbm值低于腎陽虛哮喘組(P<0.05；表1)。

表1 各組大鼠氣道重塑指標的比較 單位：μm2/m

2.4 各組大鼠肺組織中P62蛋白表達的比較

與正常組比較，哮喘組和腎陽虛哮喘組P62表達降低；古漢養(yǎng)生精不同劑量組P62表達較腎陽虛哮喘組升高(P<0.05；圖2)。

圖2 各組大鼠肺組織中P62蛋白表達的比較

2.5 各組大鼠肺組織中TGF-β1 mRNA表達的比較

與正常組比較，哮喘組及腎陽虛哮喘組TGF-β1 mRNA表達上升(P<0.05)，且腎陽虛哮喘組上升更明顯(P<0.05)；古漢養(yǎng)生精低、中、高劑量組TGF-β1 mRNA表達水平均低于腎陽虛哮喘組(P<0.05；圖3)。

圖3 各組大鼠肺組織中TGF-β1 mRNA表達的比較

3 討 論

支氣管哮喘的主要特征是包括氣道炎癥與氣道重塑，由嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞等多種細胞及炎癥介質(zhì)共同參與。研究表明，哮喘氣道的嚴重程度、氣道基底膜厚度及成纖維細胞數(shù)目與TGF-β1 mRNA的表達量呈正相關(guān)[13]。本實驗得出，哮喘組與腎陽虛哮喘組大鼠TGF-β1 mRNA的表達量較正常組明顯增多，且腎陽虛哮喘組中，TGF-β1 mRNA升高的程度較哮喘組明顯，同時數(shù)據(jù)表明其表達量與氣道重塑指標(Wat/Pbm、Wai/Pbm、Wam/Pbm)呈正相關(guān)。

自噬是由活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)的清除氧化蛋白或細胞器以減少組織損傷的一種途徑。上皮下膠原沉積增加與纖維化有關(guān)，嚴重哮喘患者的膠原沉積與自噬基因ATG5的表達有關(guān)[14]，自噬可能是通過介導(dǎo)TGF-β1促進哮喘患者氣道重塑和肺功能喪失，POON等[6]認為自噬過程是由多種因素共同進行調(diào)控的，自噬受體作為信號分子參與的各種途徑，包括NF-κB途徑和mTOR途徑[15]。miR-34a通過TGF-β1/Smad 4途徑靶向激活TGF-β1，促進不同細胞類型的自噬，同時也能促進上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換和細胞外基質(zhì)蛋白的合成[4，16-18]。P62是一種自噬相關(guān)蛋白及具有多功能的銜接蛋白，其最先被發(fā)現(xiàn)并廣泛被研究。在應(yīng)激過程中，P62參與自噬溶酶體系統(tǒng)蛋白的溶解過程，其可能是通過聚糖蛋白與P62相結(jié)合，同時通過低聚合作用在自噬體膜上與ATG8/LC3結(jié)合，形成靶向自噬體后進行降解[19]。本實驗中哮喘組及腎陽虛哮喘組大鼠P62蛋白的表達較正常組明顯下調(diào)。而P62蛋白在腎陽虛哮喘組大鼠中的表達較哮喘組顯著下降(P<0.05)，與TGF-β1 mRNA的表達、氣道重塑指標(Wat/Pbm、Wai/Pbm、Wam/Pbm)呈負相關(guān)。表明P62可能調(diào)節(jié)TGF-β1的表達促進哮喘大鼠的氣道重塑。

哮喘的發(fā)生與腎臟的虧虛密切相關(guān)，而腎陽虛被認為是哮喘疾病處于中晚期階段的主要病理機制[20]，《類證治裁》云:“肺為氣之主，腎為氣之根，肺主出氣，腎主納氣，陰陽相交，呼吸乃和，若出納升降失常，斯喘作焉”，中醫(yī)認為，哮喘在腎陽虛階段最嚴重時可能出現(xiàn)臨床表現(xiàn)。本實驗取小鼠肺組織行HE染色，腎陽虛哮喘組炎性細胞的浸潤程度較哮喘組大鼠增多，基底膜及平滑肌增厚更明顯，Wester blot檢測P62指標下降，進一步表明腎陽虛哮喘大鼠氣道重塑程度嚴重于哮喘大鼠，其中腎陽虛哮喘大鼠氣道重塑嚴重程度與P62呈負相關(guān)，與TGF-β1表達成正相關(guān)。表明腎陽虛哮喘大鼠的病理改變與TGF-β1、P62表達密切相關(guān)。

古漢養(yǎng)生精中的中藥成分包括人參、枸杞子、炙黃芪、淫羊藿、女貞子、金櫻子、菟絲子、白芍、炙甘草、炒麥芽、黃精，具有溫腎益精的作用，常用于腎精不足之癥。本實驗使用古漢養(yǎng)生精干預(yù)腎陽虛哮喘大鼠后各組TGF-β1、Wat/Pbm、Wai/Pbm、Wam/Pbm等指標較腎陽虛哮喘大鼠明顯下降，P62上升。

本實驗結(jié)果顯示，古漢養(yǎng)生精可以改善腎陽虛哮喘大鼠的氣道重塑，且與P62與TGF-β1的表達相關(guān)，故認為古漢養(yǎng)生精對腎陽虛哮喘有一定的治療作用，可能機制是通過上調(diào)P62，減少TGF-β1的表達來減輕氣道重塑，但P62及TGF-β1是否是其主要通路及具體機制尚不明確，還有待進一步實驗研究。