劉錄山， 鄧懿銘， 李 清

(1.南華大學(xué)心血管疾病研究所 動(dòng)脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南省動(dòng)脈硬化性疾病國(guó)際科技合作與創(chuàng)新聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，湖南省衡陽市 421001；2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院病理學(xué)教研室，湖南省衡陽市 421001)

缺血缺氧性腦損傷通常由腦組織出現(xiàn)急性或慢性的局部或完全缺氧所導(dǎo)致，臨床上以新生兒窒息引起的腦損傷多見[1]，是引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因，在此過程中神經(jīng)細(xì)胞凋亡起著重要角色[2]。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)是一類真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞處于低氧狀態(tài)時(shí)其表達(dá)水平升高以應(yīng)激性地對(duì)抗內(nèi)環(huán)境改變[3-4]。研究表明前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡存在相關(guān)性[5]。本課題研究缺氧是否通過調(diào)節(jié)HIF-1α表達(dá)上調(diào)PCSK9水平引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，旨在為缺血缺氧性損傷的防治提供潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

PC12細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；氯化鈷(CoCl2)購于美國(guó)西格瑪公司；DMEM培養(yǎng)基購于美國(guó)Hyclone公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自湖南艾佳生物科技公司；胎牛血清購自天津市灝洋生物制品公司；Hoechst 33258染色劑購自江蘇碧云天生物有限公司；PCSK9、HIF-1α、Caspase-3、Caspase-9、β-actin兔抗人多克隆抗體均購自Proteintech公司；Lip 2000轉(zhuǎn)染試劑、臺(tái)盼藍(lán)染色液購自北京索萊寶公司；缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑利非西呱(YC-1)、缺氧誘導(dǎo)因子激動(dòng)劑二甲基乙二?；拾彼?DMOG)購自美國(guó)Selleck公司；PCSK9小干擾RNA(PCSK9 small interfering RNA,PCSK9 siRNA)購自吉?jiǎng)P基因。倒置光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司；倒置熒光顯微鏡購自日本尼康公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海天能公司；凝膠電泳系統(tǒng)購自美國(guó)BIO-RAD公司；Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

PC12細(xì)胞于含有10%胎牛血清及1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。2～3天定期更換培養(yǎng)基，融合度70%～80%進(jìn)行傳代。使用不同濃度CoCl2(0、125、250、500 μmol/L)孵育PC12細(xì)胞24 h并觀察CoCl2對(duì)PC12細(xì)胞的影響；使用不同濃度DMOG(0、250、500、1 000 μmol/L)與250 μmol/L CoCl2共孵育PC12細(xì)胞24 h并觀察DMOG對(duì)PC12細(xì)胞的影響；使用不同濃度YC-1(0、1、10、50 μmol/L)與250 μmol/L CoCl2共孵育PC12細(xì)胞24 h并觀察YC-1對(duì)PC12細(xì)胞的影響。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，無義RNA組為siCtrl+250 μmol/L CoCl2，PCSK9 siRNA組為siPCSK9+250 μmol/L CoCl2。

1.3 蛋白印跡分析

對(duì)各個(gè)分組中的PC12細(xì)胞分別進(jìn)行處理后提取總蛋白，在培養(yǎng)瓶中加入RIPA裂解液充分作用，采用BCA法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，取含有30 μg蛋白的樣本進(jìn)行蛋白印跡法檢測(cè)，電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下作用2 h，4 ℃孵育1∶1 000稀釋的PCSK9、HIF-1α、Caspase-3、Caspase-9一抗或1∶5 000稀釋的β-actin一抗過夜，洗膜3次后室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法得到條帶并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 Hoechst 33258核染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

PC12細(xì)胞分別進(jìn)行處理后，以1×PBS潤(rùn)洗細(xì)胞3次，4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水潤(rùn)洗3次，10 min/次，每孔加入Hoechst 33258染液于避光條件下作用25 min，蒸餾水潤(rùn)洗3次，10 min/次。甘油封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Annexin V-FITC/PI染色

處理各組PC12細(xì)胞后，0.25%的胰酶1 mL消化適度后終止，吹打混勻后離心1 000 r/min 10 min，收集細(xì)胞并以1×Binding Buffer重懸，離心2 000 r/min 5 min，洗滌。1×Binding Buffer再次重懸，離心2 000 r/min 5 min后再次加入緩沖液重懸混勻后繼續(xù)加5 μL Annexin V-FITC進(jìn)行染色，于常溫下孵育15 min后再補(bǔ)入5 μL PI與200 μL緩沖液后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

PC12細(xì)胞接種于24孔板中待融合度達(dá)30%～50%后轉(zhuǎn)染，通過脂質(zhì)體Lip2000使無義siRNA與PCSK9 siRNA分別轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，并分別標(biāo)記為無義RNA組與PCSK9 siRNA組，37 ℃培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。PCSK9 siRNA正義鏈為5′-GGAGGAUAGCCUGGUUGAUdTdT-3′，反義鏈為3′-d Td TCCUCCUAUCGGACCAACUA-5′；陰性對(duì)照siRNA由吉?jiǎng)P基因公司提供。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 CoCl2對(duì)PC12細(xì)胞中HIF-1α和PCSK9表達(dá)的影響

與0 μmol/L CoCl2組比較，其他CoCl2處理組HIF-1α和PCSK9表達(dá)升高且隨CoCl2濃度的增加呈遞增趨勢(shì)(圖1)。用250 μmol/L CoCl2處理PC12細(xì)胞0、6、12、24 h，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，HIF-1α和PCSK9表達(dá)呈遞增趨勢(shì)(圖1)。

圖1 不同濃度或不同時(shí)間CoCl2處理PC12細(xì)胞對(duì)HIF-1α及PCSK9表達(dá)影響

2.2 CoCl2呈濃度依賴性促進(jìn)PC12細(xì)胞的凋亡

結(jié)果顯示隨著CoCl2濃度的增高，與核染劑Hoechst33258結(jié)合而呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染區(qū)域逐漸增多；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示凋亡率也隨之遞增(圖2)。

圖2 CoCl2呈濃度依賴性促進(jìn)PC12細(xì)胞的凋亡

2.3 DMOG對(duì)PC12細(xì)胞HIF-1α、PCSK9表達(dá)以及凋亡的影響

各濃度組DMOG均能在CoCl2誘導(dǎo)的低氧狀態(tài)下上調(diào)PC12細(xì)胞中HIF-1α、PCSK9的表達(dá)并下調(diào)Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)(圖3)。Hoechst33258染色結(jié)果及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，DMOG呈濃度依賴性抑制CoCl2導(dǎo)致的PC12凋亡(圖4)。

圖3 DMOG對(duì)PC12細(xì)胞HIF-1α和PCSK9表達(dá)以及凋亡的影響

圖4 DMOG呈濃度依賴性降低PC12細(xì)胞凋亡水平

2.4 YC-1對(duì)PC12細(xì)胞PCSK9、HIF-1α表達(dá)以及PC12細(xì)胞凋亡的影響

各濃度組YC-1均能在CoCl2誘導(dǎo)的低氧狀態(tài)下下調(diào)PC12細(xì)胞中PCSK9、HIF-1α的表達(dá)并上調(diào)Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)且表現(xiàn)出濃度依賴性(圖5)。Hoechst33258染色結(jié)果及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，YC-1呈濃度依賴性促進(jìn)PC12凋亡(圖6)。

圖5 不同濃度HIF-1α抑制劑YC-1對(duì)PC12細(xì)胞HIF-1α、PCSK9及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖6 YC-1呈濃度依賴性增加PC12細(xì)胞凋亡水平

2.5 PCSK9 siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果鑒定

與空白組及無義RNA組比較，siPCSK9組基因表達(dá)顯著下調(diào)，證明轉(zhuǎn)染效率較高，轉(zhuǎn)染成功(圖7)。

圖7 PCSK9 siRNA有效降低了PC12細(xì)胞中PCSK9表達(dá)(n=3)

2.6 PCSK9 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步探究PCSK9在CoCl2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡中的作用，進(jìn)行如下分組：空白對(duì)照組；250 μmol/L CoCl2組；250 μmol/L CoCl2+無義RNA組；250 μmol/L CoCl2+PCSK9 siRNA組。Western blot檢測(cè)顯示，與無義RNA組比較，250 μmol/L CoCl2+PCSK9 siRNA組PCSK9表達(dá)降低且Caspase-3、Caspase-9表達(dá)均減少(圖8)。Hoechst33258熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾PCSK9表達(dá)可降低CoCl2導(dǎo)致的PC12凋亡(圖9)。

圖8 PCSK9 siRNA對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中PCSK9及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖9 PCSK9 siRNA下調(diào)PC12細(xì)胞凋亡水平

3 討 論

心腦血管疾病等慢性病引起的慢性缺血缺氧仍是目前一大難題。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)oxLDL促使PC12細(xì)胞凋亡是PCSK9通過Bcl-2/Bax-Caspase-9/3信號(hào)通路所誘導(dǎo)[6]，提示PCSK9具有促神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。

HIF-1是一類細(xì)胞缺氧相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞低氧應(yīng)激下其表達(dá)上調(diào)可激活多條相關(guān)通路，但其在缺氧損傷中的作用及機(jī)制仍具有爭(zhēng)議性[7-8]，細(xì)胞種屬特異性及濃度相關(guān)的雙向性調(diào)節(jié)可能是其原因。

缺血缺氧性腦損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激、谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性、炎癥、鈣超載等都是其中可能的分子機(jī)制，而神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死是其最終結(jié)果[9]。細(xì)胞凋亡是一種多基因嚴(yán)格控制的細(xì)胞自主性、有序性的死亡，正常水平的凋亡在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及個(gè)體發(fā)育中有著重要意義，而既往神經(jīng)學(xué)研究顯示神經(jīng)細(xì)胞的加速凋亡是神經(jīng)退行性變的重要原因。研究表明缺氧使神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加[10]，且缺氧能使神經(jīng)細(xì)胞HIF-1α表達(dá)增加[8]。本研究中選用CoCl2作為細(xì)胞缺氧模擬劑對(duì)PC12進(jìn)行缺氧干預(yù)[11]，進(jìn)一步通過分級(jí)干預(yù)探究PCSK9與HIF-1α在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。結(jié)果表明：CoCl2處理下PC12細(xì)胞中PCSK9、HIF-1α以及細(xì)胞凋亡水平較對(duì)照組升高，PCSK9 siRNA轉(zhuǎn)染后，CoCl2處理下PC12細(xì)胞凋亡水平較轉(zhuǎn)染對(duì)照組下降，表明低氧狀態(tài)下PC12細(xì)胞凋亡水平升高，而HIF-1α介導(dǎo)的PCSK9表達(dá)上調(diào)是其潛在的分子機(jī)制。

綜上所述，CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞缺氧狀態(tài)能上調(diào)PC12細(xì)胞凋亡水平，HIF-1α介導(dǎo)的PCSK9表達(dá)上調(diào)是其潛在分子機(jī)制。這為缺血缺氧性腦損傷的防治提供了分子生物學(xué)依據(jù)，為缺血缺氧性腦損傷的靶向防治提供更多思路。