馬 聰 韓玉斌 陳云卿 郭文濤

(1 廣東省佛山市第一人民醫(yī)院普通婦科，佛山市 528000，電子郵箱：tronyma@126.com；2 廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，東莞市 523808)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量和健康，已經(jīng)成為婦女的第三大死因[1]。在我國，宮頸癌發(fā)病率已經(jīng)居于女性所有腫瘤的第6位[2-3]。人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的必要原因[4]。目前共發(fā)現(xiàn)50余種HPV類型，其中大約15種HPV類型可引起遠(yuǎn)期宮頸癌的發(fā)生，其中HPV-16和HPV-18是最常見的高危類型，約有70%的宮頸癌前病變或?qū)m頸癌與其相關(guān)[5]。然而，有研究表明，單獨(dú)的HPV感染不足以反復(fù)誘導(dǎo)惡性癌變，宿主的遺傳變異在宮頸癌的發(fā)生中也起到重要作用[6]。因此，研究宿主因素在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展過程中的作用機(jī)制，對(duì)制定宮頸癌的防控、治療新策略具有十分重要的意義。

HPV主要通過兩種癌蛋白E6和E7調(diào)控宿主細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[6]。細(xì)胞分裂周期蛋白6(cell division cycle 6，CDC6)是一種多功能分子開關(guān)，是DNA復(fù)制的重要調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞周期調(diào)控的激活和維持中起著重要作用。既往研究表明，CDC6的異常表達(dá)在幾種人惡性腫瘤(如肝細(xì)胞癌、肺癌、卵巢癌等)的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且CDC6的高表達(dá)與更高的腫瘤等級(jí)、更晚期的病程階段相關(guān)[7]。然而，CDC6在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用及意義尚不清楚。因此，本文研究CDC6在宮頸癌中的表達(dá)情況，以及靶向調(diào)控CDC6對(duì)HPV-16陽性宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響，從而為從基因水平闡釋宮頸癌的發(fā)病機(jī)制提供證據(jù)。

1 材料與方法

1 .1 主要材料 HPV 陰性的宮頸癌C33-A細(xì)胞株、HPV-16陽性的宮頸癌 Caski細(xì)胞株和SiHa細(xì)胞株、HPV-18 陽性的宮頸癌HeLa細(xì)胞株均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；實(shí)驗(yàn)所需的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM；批號(hào)：11995-065)和胎牛血清(批號(hào)：sh30084.03)購于美國HyClone公司；總蛋白提取試劑盒(批號(hào)：PC0020)購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；TRIzol總RNA抽提試劑盒(批號(hào)：B511321)購于上海生工公司；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(批號(hào)：11668019)購于美國Invitrogen公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)-8(cell count kit-8，CCK-8)試劑盒(批號(hào)：JV686)購于日本Dojindo公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/碘化丙啶(propidine iodide，PI)凋亡檢測試劑盒購自南京碧波生物有限公司(批號(hào)分別為S0033、C2006、C1062L)；CDC6單抗(批號(hào)：sc-9964)和β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(批號(hào)：sc-47778)購自SantaCruze公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(批號(hào)：A0545)購于美國Sigma公司；TaKaRa PrimeScriptTMReagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司(批號(hào)：RR037A；RR820A)；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate-specific proteinase 3，Caspase 3)活性檢測試劑盒 (批號(hào)：C1115)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光試劑盒(批號(hào)：P0018M)購自上海碧云天生物技術(shù)公司；PCR引物以及小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將4種宮頸癌細(xì)胞株復(fù)蘇，用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下孵育并傳代,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫印跡試驗(yàn)法檢測4種細(xì)胞CDC6蛋白的表達(dá)水平：取對(duì)數(shù)生長期的4種宮頸癌細(xì)胞，采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白濃度測定。根據(jù)待測蛋白分子量大小，制備合適濃度的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，上樣后進(jìn)行電泳分離蛋白。電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上。用5%胎牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入一抗(1 ∶500)4℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，5 min/次。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h。用TBST洗膜3次，5 min/次。采用ECL 發(fā)光試劑盒顯色，X光片曝光成像。以β-actin作為內(nèi)參。使用Image J分析軟件分析所得圖像，以條帶灰度值反映各組細(xì)胞CDC6蛋白的表達(dá)情況。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測4種細(xì)胞CDC6 mRNA的表達(dá)水平：取對(duì)數(shù)生長期的4種宮頸癌細(xì)胞，采用TRIzol法抽提細(xì)胞的總RNA，使用UV756CRT型紫外分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)測量RNA濃度。隨后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到相應(yīng)的cDNA；以此cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參，采用7500 Fast型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包括SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.5 μL、DEPC水7 μL。引物序列為CDC6上游引物為5′-CCTCTTAACTGCAGGGCTTG-3′，下游引物為5′-GGTGAGAAAAAGCAGCAAGG-3′；內(nèi)參β-actin上游引物為5′-CGTTGACA TCCGTAAAGACC-3′，下游引物為5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′。PCR的反應(yīng)條件為 95℃ 5 min、95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 40 s，共30個(gè)循環(huán)，然后72℃ 8 min。以C33-A 細(xì)胞株作為對(duì)照，采用2-ΔΔCt方法分析結(jié)果。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：將實(shí)驗(yàn)所需HPV-16陽性宮頸癌Caski細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放入37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每24 h更換培養(yǎng)液一次，密切關(guān)注細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因CDC6有效靶點(diǎn)的兩條siRNA序列，包括CDC6 siRNA-1(5′-AACUUCCCACCUUAUACCAGA-3′)和CDC6 siRNA-2(5′-AAGAAUCUGCAUGUGUGAGAC-3′)，對(duì)照序列siRNA-NC序列為 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。收集對(duì)數(shù)生長期的Caski細(xì)胞，嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書提供的方法分別將siRNA-1、siRNA-2或siRNA-NC轉(zhuǎn)染入宮頸癌Caski細(xì)胞，并設(shè)立空白對(duì)照組(細(xì)胞中只加入脂質(zhì)體)。轉(zhuǎn)染完成后，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24 h后檢測各組細(xì)胞中CDC6 mRNA的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染48 h后檢測各組細(xì)胞中CDC6蛋白的表達(dá)水平，篩選有效干擾序列。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況：確定干擾序列后，按1.2.4方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取轉(zhuǎn)染24 h后且細(xì)胞密度良好的各組Caski細(xì)胞，以1 500個(gè)/孔接種在96孔板，每組設(shè)立6個(gè)復(fù)孔。將接種好的96孔板置于培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后吸走各孔培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌細(xì)胞后向各孔加入10 μL的CCK-8反應(yīng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，采用Multiskan Sky型酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)測定450 mm波長處各孔的吸光度值。為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，各組取6孔計(jì)算平均值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率：確定干擾序列后，按1.2.4方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，放入離心管，常溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清后加入PBS洗滌2次，加入預(yù)冷的無水乙醇固定細(xì)胞，4℃固定過夜，常溫下1 000 r/min離心5 min，將殘留在細(xì)胞上的乙醇除去，加入PBS洗滌，加入RNA酶孵育20 min后用400目濾網(wǎng)過濾，常溫下1 000 r/min離心5 min去除PBS。加PI染液避光染色30 min，使用CytoFLEX型流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)分析細(xì)胞周期。采用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況，將細(xì)胞消化后棄上清收集細(xì)胞，PBS洗滌后加入500 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞，加5 μL Annexin V-FITC到細(xì)胞懸液中避光孵育15 min，再加10 μL PI，混勻后避光孵育5 min，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。使用MultiCycle軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 CDC6在4種宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況 Caski細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、SiHa細(xì)胞、C33-A細(xì)胞的CDC6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量依次降低(均P<0.05)；C33-A細(xì)胞CDC6蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于其他3種細(xì)胞，Caski細(xì)胞和HeLa細(xì)胞CDC6蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于SiHa細(xì)胞(均P<0.05)，但Caski細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的CDC6蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1和圖1。

表1 4種宮頸癌細(xì)胞中CDC6 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

圖1 不同宮頸癌細(xì)胞中CDC6蛋白的表達(dá)情況

2.2 CDC6 siRNA轉(zhuǎn)染后的效果和有效干擾序列的篩選 CDC6 siRNA-1組和CDC6 siRNA-2組的CDC6 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量低于其他兩組(均P<0.05)，且CDC6 siRNA-1組的相對(duì)表達(dá)量低于CDC6 siRNA-2組(P<0.05)，但siRNA-NC組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此可見，CDC6 siRNA-1的基因沉默效果更好，故選用siRNA-1進(jìn)行后續(xù)研究。見表2及圖2。

表2 轉(zhuǎn)染后Caski細(xì)胞中CDC6 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量(±s)

圖2 轉(zhuǎn)染后各組Caski 細(xì)胞中CDC6蛋白的表達(dá)情況

2.3 各組Caski細(xì)胞的增殖情況 轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，CDC6 siRNA-1組增殖能力均低于siRNA-NC組、空白對(duì)照組(均P<0.05)，而siRNA-NC組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組Caski細(xì)胞的吸光度值(±s)

2.4 各組Caski細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡率的比較 與其他兩組比較，CDC6 siRNA-1組的細(xì)胞G1期變長、G2期縮短，且細(xì)胞凋亡率增高(均P<0.05)，見表4及圖3。

表4 轉(zhuǎn)染后Caski細(xì)胞周期和凋亡率的比較(±s，%)

圖3 3組Caski細(xì)胞凋亡情況

3 討 論

宮頸癌是全球女性癌癥死亡的主要原因之一，其中近99%的宮頸癌病例與HPV高危類型有關(guān)[8]。HPV感染主要侵襲黏膜上皮細(xì)胞或皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞。在正常生理情況下，上皮細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞周期后終末分化。然而當(dāng)上皮細(xì)胞感染HPV高危類型后，病毒E6和E7基因編碼蛋白干擾關(guān)鍵的細(xì)胞周期通路，并在HPV陽性宮頸癌組織中持續(xù)表達(dá)，誘導(dǎo)DNA損傷和基因組的不穩(wěn)定[9-10]。雖然體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)E7的表達(dá)可以促使細(xì)胞永生化，但它并不足以誘導(dǎo)惡性癌變[11]。因此，臨床上HPV-16感染的女性雖多，但只有少部分會(huì)患上癌癥。這些結(jié)果均表明，從HPV感染到侵襲性癌癥的進(jìn)展與宿主的遺傳變異密切相關(guān)。

宿主內(nèi)DNA復(fù)制是一個(gè)“全或無”的過程，整個(gè)過程受“復(fù)制前復(fù)合物”的嚴(yán)格調(diào)節(jié)。人CDC6基因定位于17q21.3，其表達(dá)受控制S期促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄因子E2F家族的調(diào)控[12]。CDC6也是復(fù)制前復(fù)合物的組成成分，其在人類細(xì)胞由S期向M期的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。嚴(yán)重缺乏CDC6的細(xì)胞不能激活DNA損傷檢測系統(tǒng)的檢驗(yàn)點(diǎn)，無法進(jìn)入有絲分裂階段。有研究表明，沉默或抑制CDC6基因可使細(xì)胞阻滯于G1/S期，雖不完全抑制DNA復(fù)制但可促使細(xì)胞凋亡。相反，CDC6的異常表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖并具有致癌的風(fēng)險(xiǎn)[13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CDC6主要在宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)以及侵襲性宮頸癌組織中高表達(dá)，其免疫組化結(jié)果可作為診斷宮頸細(xì)胞惡變的標(biāo)志物之一[14]。但是，目前對(duì)于宮頸癌發(fā)生和發(fā)展過程中CDC6發(fā)揮的作用尚不清楚。HPV編碼的E6、E7蛋白與HPV的致癌作用密切相關(guān)，其中E7是HPV的主要轉(zhuǎn)化蛋白，能夠降解抑癌蛋白pRB[15]。最近的研究顯示，HPV-16 E7 能夠?qū)DC6的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)CDC6蛋白表達(dá)并延長其半衰期，在DNA出現(xiàn)損傷的情況下其作用更加顯著[16]。結(jié)合上述文獻(xiàn)，我們提出假設(shè)：CDC6作為控制DNA增殖和細(xì)胞周期的重要分子之一，與HPV-16陽性宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

本研究選取了HPV陰性的宮頸癌 C33-A 細(xì)胞株、HPV16 陽性的宮頸癌 Caski細(xì)胞株和 SiHa 細(xì)胞株、HPV18陽性的宮頸癌HeLa細(xì)胞株4種不同的宮頸癌細(xì)胞株進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，Caski細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、SiHa細(xì)胞、C33-A細(xì)胞的CDC6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量依次降低；C33-A細(xì)胞CDC6蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于其他3種細(xì)胞，Caski細(xì)胞和HeLa細(xì)胞CDC6蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于SiHa細(xì)胞(均P<0.05)。這提示，在HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞中CDC6呈高表達(dá)，CDC6可能是調(diào)控HPV的一個(gè)靶基因。為進(jìn)一步研究CDC6的作用，我們選擇CDC6表達(dá)量最高的HPV-16陽性宮頸癌Caski細(xì)胞株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA沉默Caski細(xì)胞中的CDC6后，細(xì)胞的增殖力下降，細(xì)胞凋亡率升高，G1延長，G2期縮短。提示沉默CDC6表達(dá)后導(dǎo)致細(xì)胞無法由G1期進(jìn)入到S期，細(xì)胞進(jìn)程受阻，增殖受到抑制，這與Robles等[17]的研究結(jié)果相似。由此可見，CDC6在宮頸癌Caski細(xì)胞增殖和周期調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，CDC6在HPV-16陽性宮頸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，而沉默CDC6的表達(dá)可以選擇性地抑制癌細(xì)胞的異常增殖，這表明CDC6在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。在今后的研究中深入探索CDC6影響宮頸癌病情進(jìn)展、惡性程度及預(yù)后恢復(fù)過程的具體作用機(jī)制，將有助于更好地了解宮頸癌的發(fā)生原理，為宮頸癌的臨床診治提供理論依據(jù)，對(duì)開展宮頸癌的基因治療起到推動(dòng)作用。