金旭，包先麗，張春芳，楊科

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種病情嚴重、并發(fā)癥多、病死率較高的急腹癥，占全部急性胰腺炎的10%～20%。SAP發(fā)生時，機體處于應激狀態(tài)，伴發(fā)高代謝、胰島素抵抗及胰腺功能紊亂等，患者易出現應激性高血糖[1]。隨著生物分子技術的發(fā)展，人們發(fā)現多種微小RNA(miRNA)在各個疾病中發(fā)揮重要作用。多項基礎研究發(fā)現，微小RNA-223(miR-223)通過多種通路參與小鼠炎性反應的發(fā)生發(fā)展，且與病情嚴重程度有關[2-3]；另有報道稱miR-223在胰腺癌患者血清中表達上調，提高了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力[4]。然而關于miR-223在胰腺炎中的研究國內外鮮見報道。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一組序列高度保守的核蛋白，分布于機體各重要器官組織中，作為一種晚期炎性介質，參與機體炎性反應的發(fā)生、發(fā)展及轉歸，已有研究報道其在急性胰腺炎、慢性腎衰竭血透、膿毒癥等中發(fā)揮重要作用[5-7]。但二者在SAP合并應激性高血糖患者中的表達情況，尚未有報道。因此，現分析合并應激性高血糖老年SAP患者血清miR-223、HMGB1水平及其臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年9月—2020年9月于北京市和平里醫(yī)院急診科診治的老年SAP患者108例為研究對象，男62例，女46例，年齡60～81(71.18±3.84)歲。以入院后24 h空腹血糖(FPG)水平≥6.9 mmol/L診斷為應激性高血糖[8]，并據此分為合并應激性高血糖組(高血糖組)57例，正常血糖組51例。2組患者性別、年齡、體質量指數(BMI)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平、病因、家族史比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高血糖組患者急性生理學與慢性健康狀況評分Ⅱ(APACHE Ⅱ)[9]、FPG、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)顯著高于正常血糖組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。本研究經醫(yī)院倫理委員會審核批準(審批號：2017-P2-07-09)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

表1 2組老年SAP患者臨床資料比較

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①所有患者均符合“中國急性胰腺炎診治指南(2019年,沈陽)”[10]中有關SAP的診斷標準；首次發(fā)病且病程≤2 d；③臨床資料完整。(2)排除標準：①合并惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾??；②合并糖尿病患者；③近1個月服用過對血清生化指標有影響的藥物患者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清miR-223水平檢測：入院后抽取患者晨起空腹肘靜脈血5 ml，離心將上層清液移至干凈EP管，-20 ℃冰箱保存待測。利用熒光定量PCR技術檢測血清miR-223水平。將血清先以TRIzol試劑(美國Sigma公司)提取總RNA，測定其濃度和純度，以OD260/OD280值在1.8～2.0判斷為純度較好。使用PrimeScript RT反轉錄試劑盒(美國Thermo Scientific公司)將RNA反轉錄為cDNA，采用PCR擴增試劑盒(美國Thermo Scientific公司)進行相關反應。miR-223以U6為內參，由上海生工生物工程公司合成。miR-223上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTC-3’，下游引物：5’-CTCAACTGGTGGTCGTGGAGTCGGCAA-3’；U6上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATATA-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTG-3’。循環(huán)參數：95 ℃孵育10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)，72 ℃延長10 min。用2-△△Ct法計算miR-223水平。

1.3.2 血清HMGB1水平檢測：上述血清利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清HMGB1水平(試劑盒購自北京百奧萊博生物科技有限公司)，檢測方法按照說明書步驟進行。

1.3.3 預后情況：治療后，患者癥狀恢復正常或與治療前相比，機體功能大幅改善為預后良好；患者癥狀無明顯改善或者加重，甚至死亡為預后不良。

1.4 病情判定 根據患者進入ICU或手術情況進行APACHE Ⅱ評分，分值越高提示病情越嚴重[9]。

2 結 果

2.1 2組血清miR-223、HMGB1水平比較 合并應激性高血糖組患者血清miR-223、HMGB1水平均顯著高于正常血糖組(P<0.01)，見表2。

表2 2組老年SAP患者血清miR-223、HMGB1水平比較

2.2 高血糖組預后情況 合并應激性高血糖老年SAP患者經治療后根據各項實驗室指標及癥狀恢復情況分為預后良好亞組26例和預后不良亞組31例，預后不良亞組APACHE Ⅱ評分為(16.73±5.27)分，高于預后良好亞組的(11.53±5.21)分，差異有統(tǒng)計學意義(t/P=3.730/0.000)。

2.3 2亞組患者血清miR-223、HMGB1水平比較 預后不良亞組患者血清miR-223、HMGB1水平高于預后良好亞組(P<0.01)，見表3。

表3 2亞組合并應激性高血糖老年SAP患者血清miR-223、HMGB1水平比較

2.4 血清miR-223、HMGB1對合并應激性高血糖老年SAP患者預后不良的診斷價值 ROC曲線分析結果顯示，血清miR-223、HMGB1預測合并應激性高血糖老年SAP患者預后不良的曲線下面積(AUC)分別為0.881(95%CI0.768～0.952)、0.911(95%CI0.805～0.960)，敏感度分別為77.42%、80.65%，特異度分別為88.46%、96.15%，二者聯(lián)合診斷的AUC為0.952(95%CI0.860～0.971)，敏感度和特異度分別為93.55%、88.46%，見圖1、表4。

表4 血清miR-223、HMGB1對合并應激性高血糖老年SAP患者預后不良的診斷價值比較

2.5 影響合并應激性高血糖老年SAP患者預后不良的危險因素分析 以合并應激性高血糖SAP患者預后情況為因變量，以血清miR-223、HMGB1水平及APACHE Ⅱ評分為自變量進行多因素Logistic分析，結果顯示，血清高miR-223水平、高HMGB1水平及高APACHE Ⅱ評分是影響合并應激性高血糖SAP患者預后不良的危險因素，見表5。

表5 影響合并應激性高血糖老年SAP患者預后不良的危險因素分析

注：SAP.重癥急性胰腺炎；miR-223.微小RNA-223；HMGB1.高遷移率族蛋白1圖1 血清miR-223、HMGB1預測合并應激性高血糖老年SAP患者預后不良的ROC曲線

3 討 論

SAP患者并發(fā)應激性高血糖是一種臨床常見癥狀，導致SAP患者血糖升高的可能原因為患者在應激狀態(tài)下胰島B細胞功能被破壞，胰島素分泌量減少，分解血糖減少，患者效應細胞受體下調，產生胰島素抵抗，導致血糖水平上升。臨床研究發(fā)現，有60%左右行外科大手術的患者發(fā)生血糖升高[11]，高血糖提示胰腺功能不全，在急性胰腺炎期間或之后更容易發(fā)生。加強SAP患者術后監(jiān)護及血糖控制，對減少感染、改善預后具有重要意義。

miRNAs是一類長度約為22個氨基酸的非編碼單鏈RNA分子，由內源性基因編碼，在細胞中調控基因表達發(fā)揮生理作用[12]。miRNAs表達紊亂通常與疾病發(fā)展的各個病理過程有關。Guan等[13]研究發(fā)現，在新生大鼠小膠質細胞受損后，miR-223-5p水平在1周內顯著上升，在第3天達到高峰，而相應抑制劑可明顯降低miR-223-5p蛋白表達，提示抑制miR-223-5p表達可減輕脊髓受損后的炎性反應。本研究結果顯示，合并應激性高血糖組老年SAP患者血清miR-223水平顯著高于正常血糖組，且合并應激性高血糖老年SAP患者中預后不良亞組血清miR-223水平高于預后良好亞組，提示血清miR-223可能參與合并應激性高血糖老年SAP患者病情的發(fā)生發(fā)展，其水平高表達可能是導致患者預后不良的原因。結合Guan等[13]研究可知，靶向抑制miR-223表達可能是治療SAP的潛在有效方法。隨著對急性胰腺炎的深入研究，細胞因子在SAP發(fā)展中的作用越來越受到重視[14-15]。巨噬細胞介導的炎性反應是一種強有力的生物反應，通過消除有害物質在維持組織內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用[16]。另有學者研究報道稱[17]，Kruppel樣因子6基因在分子水平通過占據巨噬細胞啟動子區(qū)直接抑制miR-223的表達來促進炎性反應，發(fā)揮毒性作用。由此推測miR-223可能通過調控炎性介質活化或通路激活，參與SAP的發(fā)生發(fā)展，具體作用機制有待進一步研究。

本結果顯示，合并應激性高血糖組老年SAP患者血清HMGB1水平顯著高于正常血糖組，且合并應激性高血糖老年SAP患者中預后不良亞組血清HMGB1水平高于預后良好亞組，提示血清HMGB1參與SAP患者炎性反應損害過程，其表達水平越高患者病情越嚴重，預后越差。分析其原因，HMGB1是SAP患者全身性炎性反應的重要介質，發(fā)生SAP時，HMGB1被主動釋放到胞外進入外循環(huán)，與晚期糖基化終末產物受體特異性結合傳遞胞內信號，介導細胞反應，如釋放促炎因子、激活炎性反應等[18-19]。研究發(fā)現，SAP患者腸黏膜通透性增加，屏障功能受損，細菌侵襲作用增強，使胰腺組織發(fā)生繼發(fā)性感染，進一步刺激活化單核巨噬細胞分泌炎性介質如白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，而TNF-α是導致全身炎性反應綜合征和多器官功能障礙綜合征的直接原因[20-22]。由于HMGB1晚于TNF-α、IL-6等早期炎性因子出現，并且持續(xù)時間較長，故稱之為晚期炎性因子，多項研究發(fā)現，HMGB1在心肌細胞再灌注損傷、血腦屏障功能障礙等重要組織器官病變中發(fā)揮作用[23-25]。由此推測，在HMGB1大量合成分泌之前，機體就處于炎性浸潤狀態(tài)，及早治療是改善SAP患者預后的有效方法。ROC分析結果顯示，血清miR-223、HMGB1預測合并應激性高血糖老年SAP患者預后不良的AUC分別為0.881、0.911，二者聯(lián)合檢測的AUC為0.952，提示血清miR-223、HMGB1對患者預后均有一定的預測價值，聯(lián)合檢測的診斷效能更好。進一步Logistic分析顯示，血清高miR-223水平、高HMGB1水平、高APACHE Ⅱ評分均是影響合并應激性高血糖SAP患者預后不良的危險因素，提示在校正APACHE Ⅱ評分后，血清miR-223、HMGB1水平仍然與合并應激性高血糖SAP患者預后密切相關。

綜上所述，合并應激性高血糖老年SAP患者血清miR-223、HMGB1呈高表達，血清miR-223、HMGB1水平升高與患者預后不良密切相關，提示監(jiān)測合并應激性高血糖老年SAP患者血清miR-223、HMGB1對判斷患者病情發(fā)展、改善患者預后具有一定的臨床意義。但SAP患者伴發(fā)血糖升高是個復雜的過程，血清miR-223、HMGB1在SAP腸道黏膜屏障損傷、血糖升高中的具體作用機制仍未明確，有待更深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

金旭：設計研究方案，實施研究過程，課題設計，論文撰寫；包先麗：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；張春芳：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；楊科：進行統(tǒng)計學分析