高 冰，徐 帥，韓魯佳，劉 賢

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083

引 言

農(nóng)業(yè)部第1773號(hào)公告《飼料原料目錄》將動(dòng)物油脂列入了飼料原料目錄，作為飼料中重要的能量物質(zhì)被廣泛添加在各類(lèi)畜禽飼料中[1]。目前，市場(chǎng)上常見(jiàn)的飼用動(dòng)物油脂為魚(yú)油、 豬脂、 牛脂和家禽油脂。其中魚(yú)油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、 產(chǎn)量低、 提煉工藝復(fù)雜[2]，因此魚(yú)油的價(jià)格高于其他飼用動(dòng)物油脂。受利益驅(qū)使，市面上魚(yú)油的摻偽現(xiàn)象嚴(yán)重，其中陸生動(dòng)物油脂是魚(yú)油中常見(jiàn)的摻假物質(zhì)[3]。飼用魚(yú)油摻偽陸生動(dòng)物油脂的行為不僅擾亂市場(chǎng)，嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者的權(quán)益，反芻動(dòng)物油脂摻假更可能導(dǎo)致“瘋牛病”隨著養(yǎng)殖環(huán)節(jié)傳播[4]。

目前，國(guó)內(nèi)外常用的油脂摻偽檢測(cè)技術(shù)為基于脂肪酸組分檢測(cè)的氣相色譜法[5]。該方法雖能對(duì)樣品化學(xué)組分進(jìn)行直接檢測(cè)，但操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)操作人員有嚴(yán)格的技術(shù)要求，不適合大樣本量的檢測(cè)[6]。與之相比，光譜法具有無(wú)需樣品預(yù)處理、 兼顧檢測(cè)精度與檢測(cè)效率等優(yōu)點(diǎn)，符合現(xiàn)階段產(chǎn)業(yè)的需求。有研究表明，光譜法可以運(yùn)用于魚(yú)油的摻假鑒別[7]。Bellorini等利用FTIR光譜技術(shù)檢測(cè)魚(yú)油中的牛脂摻假[8]； Rohman等利用光譜法鑒別魚(yú)肝油中的豬脂、 牛脂和羊脂的摻假[9]； Xu等開(kāi)展了魚(yú)油中單類(lèi)別陸生動(dòng)物油脂摻假紅外光譜判別分析的可行性研究，并探討了魚(yú)油中陸生動(dòng)物油脂的檢出限[10]。以上研究均對(duì)魚(yú)油與摻假陸生動(dòng)物油脂魚(yú)油之間進(jìn)行單類(lèi)別判別分析，并未對(duì)多類(lèi)別判別的可行性與效果進(jìn)行探討。

多類(lèi)別判別分析方法廣泛應(yīng)用于油脂[11]、 飼料[12]、 葡萄酒[13]等食品的真實(shí)性和摻假研究。與多類(lèi)別判別分析方法可以確證特定的摻假物不同，單類(lèi)別判別分析只能篩查樣本是否為摻假樣本[14]。因此，單類(lèi)別判別分析模型常應(yīng)用于大樣本量的快速篩選[15]。

本研究提出一種連續(xù)分類(lèi)策略(單類(lèi)別判別分析篩查+多類(lèi)別判別分析確證)探究飼用魚(yú)油中摻假陸生動(dòng)物油脂的紅外光譜鑒別分析潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 動(dòng)物油脂樣品的收集與制備

供試動(dòng)物油脂樣品共50個(gè)，包括魚(yú)油12個(gè)、 豬脂10個(gè)、 雞油9個(gè)、 牛脂10個(gè)和羊脂9個(gè)，收集自全國(guó)不同的飼用油脂企業(yè)。樣品均經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測(cè)，無(wú)交叉污染。

采用均勻混合法進(jìn)行飼用魚(yú)油中摻加陸生動(dòng)物油脂的樣品制備，獲得摻假豬脂的魚(yú)油樣品40個(gè)，豬脂含量(W/W)范圍： 2.9%～49.4%； 摻假雞油的魚(yú)油樣品40個(gè)，雞油含量(W/W)范圍： 3.1%～51.3%； 摻假牛脂的魚(yú)油樣品40個(gè)，牛脂含量(W/W)范圍： 2.8%～50.6%； 摻假羊脂的魚(yú)油樣品40個(gè)，羊脂含量(W/W)范圍： 2.9%～50.3%。樣品總計(jì)160個(gè)。

1.2 紅外光譜數(shù)據(jù)分析

紅外光譜儀Perkin Elmer FTIR Spectrum 400(美國(guó)Perkin Elmer公司)，采用衰減全反射附件。光譜采集范圍為4 000～550 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32，每個(gè)樣品重復(fù)掃描3次取平均光譜。使用SNV，Smoothing，Autoscale等方法預(yù)處理光譜數(shù)據(jù)。

1.3 分析方法

采用主成分分析(PCA)進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)分類(lèi)探索性分析。采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)進(jìn)行定性判別分析。所用軟件為Matlab(R2015a，美國(guó)Mathworks公司)。采用殘差統(tǒng)計(jì)剔除異常值，置信區(qū)間設(shè)為95%。為防止過(guò)擬合，使用“l(fā)eave one out”法進(jìn)行交互驗(yàn)證[16]。通過(guò)Hotelling T2和Q殘差值進(jìn)行異常樣本的剔除。以識(shí)別率、 拒絕率和誤判率作為判別模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中識(shí)別率和拒絕率越接近1，誤判率越接近0，說(shuō)明判別分析效果越好[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 主成分分析

采用PCA對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行探索性分析，如圖1所示，前兩個(gè)主成分分別占總變異系數(shù)的62.54%和12.41%。可以看出，純魚(yú)油和摻假陸生動(dòng)物油脂魚(yú)油之間得到了較好的區(qū)分，不存在相互混雜的樣品； 摻假反芻動(dòng)物油脂的魚(yú)油樣品主要分布在第二主成分的正方向，牛脂和羊脂摻假樣品相互混雜，區(qū)分效果差； 摻假非反芻動(dòng)物油脂的魚(yú)油樣品主要分布在第二主成分的負(fù)方向，同樣可以看到豬脂和雞油摻假樣品相互混雜，區(qū)分效果差； 反芻動(dòng)物油脂摻假樣品和非反芻動(dòng)物油脂摻假樣品之間雖有少量的重疊，總體上區(qū)分較為明顯。

2.2 單類(lèi)別摻假魚(yú)油判別分析

建立魚(yú)油中是否摻假陸生動(dòng)物油脂的單類(lèi)別PLS-DA判別模型，圖2為摻假陸生動(dòng)物油脂魚(yú)油單類(lèi)別預(yù)測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，純樣品和摻假樣品的識(shí)別率和拒絕率均為100.00%。OC-PLS分析結(jié)果同樣表明純樣品和摻假樣品的識(shí)別率和拒絕率均為100.00%。說(shuō)明中紅外光譜技術(shù)可以準(zhǔn)確判別純魚(yú)油和摻假陸生動(dòng)物油脂魚(yú)油，可作為快速工具應(yīng)用于魚(yú)油樣品是否摻假陸生動(dòng)物油脂的篩查。

圖1 基于純魚(yú)油和摻假陸生動(dòng)物油脂魚(yú)油紅外光譜的主成分得分圖

圖2 單類(lèi)別PLS-DA判別模型結(jié)果Fig.2 Results of PLS-DA one-class model

2.3 多類(lèi)別摻假魚(yú)油判別分析

為了進(jìn)一步確證摻假陸生動(dòng)物油脂的種屬源，建立魚(yú)油中是否摻假陸生動(dòng)物油脂的多類(lèi)別PLS-DA判別模型： 按照豬脂摻假、 雞油摻假、 牛脂摻假和羊脂摻假劃分類(lèi)別建立判別1模型； 按照非反芻動(dòng)物油脂摻假和反芻動(dòng)物油脂摻假劃分類(lèi)別建立判別2模型。模型結(jié)果如表1、 表2所示。

判別1和判別2結(jié)果均表明，純魚(yú)油樣品的不確定性分類(lèi)樣品比率為0.00%，識(shí)別率和拒絕率均為100.00%，這一結(jié)果與單類(lèi)別判別模型結(jié)果相同。圖3(a)和圖3(f)的判別線將純魚(yú)油樣品和摻假陸生動(dòng)物油脂樣品成功區(qū)分，未出現(xiàn)混雜樣品。

對(duì)判別1的結(jié)果進(jìn)行分析，牛脂、 豬脂、 羊脂和雞油摻假樣品的不確定性分類(lèi)比率依次降低，分別為43.59%，30.00%，20.08%和15.38%(表1)； 整體的識(shí)別率和拒絕率在82.10%和92.30%(表1)之間； 其中雞油摻假樣品的拒絕率和識(shí)別率最高，誤判率為7.70%(表1)，不確定分類(lèi)樣品比率最低，判別效果最優(yōu)。圖3(b)中摻假豬脂樣品有多個(gè)樣品并未正確分類(lèi)，且少量雞油摻假樣品和牛脂摻假樣品被判定為豬脂摻假樣品； 圖3(c)中部分豬脂摻假樣品被誤判為雞油摻假樣品； 圖3(d)和圖3(e)為摻假牛脂和摻假羊脂樣品的判別1預(yù)測(cè)結(jié)果，牛脂摻假和羊脂摻假樣品相互誤判現(xiàn)象明顯。上述討論表明，豬脂摻假樣品和雞油摻假樣品互為主要的誤判樣品來(lái)源，牛脂摻假樣品和羊脂摻假樣品同樣相互混雜現(xiàn)象嚴(yán)重，此分析與PCA結(jié)果一致。

表1 魚(yú)油摻假陸生動(dòng)物油脂種屬PLS-DA多類(lèi)別判別1預(yù)測(cè)結(jié)果Table 1 Results of first PLS-DA multi-class predictions

表2 魚(yú)油摻假陸生動(dòng)物油脂種屬PLS-DA多類(lèi)別判別2預(yù)測(cè)結(jié)果Table 2 Results of second PLS-DA multi-class predictions

圖3 多類(lèi)別PLS-DA判別模型結(jié)果(a): 純魚(yú)油判別1結(jié)果； (b): 豬脂摻假判別1結(jié)果； (c): 雞油摻假判別1結(jié)果； (d): 牛脂摻假判別1結(jié)果；(e): 羊脂摻假判別1結(jié)果； (f): 純魚(yú)油判別2結(jié)果； (g): 非反芻動(dòng)物油脂摻假判別2結(jié)果； (h): 反芻動(dòng)物油脂摻假判別2結(jié)果Fig.3 Results of PLS-DA multi-class model(a)： Discrimination 1 for pure fish oil; (b)： Discrimination 1 for lard; (c)： Discrimination 1 for chicken oil; (d)： Discrimination 1 for tallow； (e)： Discrimination 1 for suet； (f)： Discrimination 2 for pure fish oil; (g)： Discrimination 2 for non-ruminant lipid; (h)： Discrimination 2 for ruminant lipid

基于上述分析，重新劃分判別類(lèi)別，判別2的結(jié)果表明，摻假陸生動(dòng)物油脂樣品的不確定性分類(lèi)比率均下降到10%以內(nèi)，其中非反芻動(dòng)物油脂摻假樣品和反芻動(dòng)物油脂摻假樣品的不確定性分類(lèi)比率分別為6.33%和6.41%(表2)； 整體拒絕率和識(shí)別率提升至90%以上，反芻動(dòng)物油脂摻假樣品的判別效果較優(yōu)，識(shí)別率和拒絕率分別為97.40%和96.70%(表2)，誤判率為2.90%(表2)。圖3(g)和圖3(h)所示的摻假非反芻和反芻動(dòng)物油脂魚(yú)油的判別2預(yù)測(cè)結(jié)果表明，摻假反芻和非反芻動(dòng)物油脂摻假樣品之間的混雜樣品較少，這一結(jié)果同樣與PCA結(jié)果基本一致。

結(jié)果表明PLS-DA結(jié)合中紅外光譜技術(shù)可以判別純魚(yú)油和多類(lèi)別陸生動(dòng)物油脂摻假魚(yú)油，可應(yīng)用于魚(yú)油樣品摻假陸生動(dòng)物油脂種屬源的確證分析。

3 結(jié) 論

一種快速篩查結(jié)合確證分析的連續(xù)分類(lèi)策略應(yīng)用于魚(yú)油摻假陸生動(dòng)物油脂的檢測(cè)。中紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)可以篩分純魚(yú)油和摻假陸生動(dòng)物油脂魚(yú)油，識(shí)別率和拒絕率均為100.00%，所建立的多類(lèi)別判別模型可以進(jìn)一步確證摻假陸生動(dòng)物種屬源，拒絕率和識(shí)別率均達(dá)到82.00%以上，其中雞油摻假樣品和反芻動(dòng)物油脂摻假樣品判別效果最優(yōu)。該方法作為一種快速篩查與確證分析工具可滿足大樣本量魚(yú)油中陸生動(dòng)物油脂摻假的檢測(cè)需求。