黃雅平，莊伊凡，程 晶，李 琴

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 泉州 362000；2.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院胃腸外科，福建 廈門 361000；3.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院胃腸腫瘤研究所，福建 廈門 361000)

胃癌是世界上最具侵襲性的惡性腫瘤之一，雖然近10年來其診斷及治療已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步，但患者5年生存率仍只有25%。積極化療是預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移最重要的治療手段[1-2]。然而，腫瘤細(xì)胞固有或獲得性耐藥是目前影響化療效果的關(guān)鍵因素[2]。姜黃素作為一種安全的天然藥物，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用。研究表明，姜黃素與西紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶等化療藥物聯(lián)合使用，在前列腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌等多種人類腫瘤中具有抗癌增敏作用，但是相關(guān)機(jī)制尚不明確[3-4]。Wnt/β-catenin信號通路不僅在細(xì)胞多能性調(diào)控和惡變誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，還與腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性密切相關(guān)[5]。我們前期的研究證實，姜黃素可調(diào)控Wnt信號通路，抑制胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，實現(xiàn)抗腫瘤作用[6-7]。因此，本研究擬探討姜黃素對多藥耐藥胃癌細(xì)胞的化療增敏作用以及Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

姜黃素(美國Sigma公司)，順鉑(齊魯藥業(yè)有限公司)，5-氟尿嘧啶(5-Fu，美國Selleck Chemicals公司)，人胃癌耐藥細(xì)胞株BGC-823/5-Fu(南京科佰生物科技有限公司)，噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒(天津百浩生物科技有限公司)，Pierce BCA Protein試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔抗人E-cadherin、Vimentin、Wnt2、β-catenin、GSK3β克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞分組

采用姜黃素(10 μmol/L)、順鉑(1 μmol/L)單獨或聯(lián)合干預(yù)人胃癌耐藥細(xì)胞株BGC-823/5-Fu，并分為對照組、姜黃素干預(yù)組、順鉑干預(yù)組、聯(lián)合干預(yù)組。BGC-823/5-Fu細(xì)胞株于37 ℃、5% CO2飽和濕度下含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中加入5 μmol/L 5-Fu維持細(xì)胞耐藥性進(jìn)行預(yù)處理，實驗前1周撤藥，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 MTT試驗檢測細(xì)胞增殖能力

取對數(shù)生長期的BGC-823/5-Fu細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為2×105/L，每孔200 μL接種于96孔板。按1.2方法干預(yù)后，于37 ℃孵育24 h。每孔加入MTT溶液10 μL繼續(xù)培養(yǎng)，在24 h、48 h、72 h時置酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測各孔的吸光度OD值，評估細(xì)胞活力。

1.4 集落形成試驗檢測細(xì)胞克隆成瘤能力

取對數(shù)生長期的耐藥細(xì)胞株BGC-823/5-Fu制備單細(xì)胞懸液接種于6孔板(每孔2 000個)孵育24 h。按1.2方法干預(yù)后培養(yǎng)24 h。PBS洗滌后繼續(xù)培養(yǎng)10 d，終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，PBS浸洗，甲醇固定，空氣干燥，Giemsa染液染色10 min，采用凝膠分析儀分析集落形成情況。

1.5 Transwell小室試驗檢測細(xì)胞遷移能力

按照1.2方法干預(yù)誘導(dǎo)72 h后收集各組細(xì)胞，調(diào)整濃度，去血清饑餓后制備細(xì)胞懸液，24孔板每孔上室加200 μL細(xì)胞懸液，下室加500 μL 20% FBS培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)24 h。取出小室，棄液洗滌，固定后高倍鏡(×200)下觀察。隨機(jī)取5個視野計數(shù)平均遷移細(xì)胞數(shù)。

1.6 Wnt/β-catenin信號通路及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

收集和提取對數(shù)生長期的耐藥細(xì)胞株BGC-823/5-Fu接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)。按1.2方法干預(yù)各組細(xì)胞后培養(yǎng)24 h，裂解獲得總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，各取50 μg上樣，電泳(80 V，30 min；120 V至結(jié)束)轉(zhuǎn)PVDF膜(300 mA，100 min)，一抗4 ℃搖床孵育過夜，室溫下水平搖床二抗孵育1 h，TBST漂液，ECL顯影。以β-actin為內(nèi)參，Western blot檢測E-cadherin、Vimentin、Wnt2、β-catenin、GSK3β蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 姜黃素下調(diào)BGC-823/5-Fu細(xì)胞活力

干預(yù)后24 h、48 h，姜黃素干預(yù)組、順鉑干預(yù)組OD值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后72 h，姜黃素干預(yù)組、順鉑干預(yù)組OD值低于對照組(P<0.05)。干預(yù)后48 h，聯(lián)合干預(yù)組OD值低于對照組、姜黃素干預(yù)組(P<0.05)。干預(yù)后72 h，聯(lián)合干預(yù)組OD值低于對照組、姜黃素干預(yù)組、順鉑干預(yù)組(P<0.05)。在各干預(yù)時間點，姜黃素干預(yù)組與順鉑干預(yù)組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

*：與對照組比較，P<0.05；#：與姜黃素干預(yù)組比較，P<0.05；△：與順鉑干預(yù)組比較，P<0.05

2.2 姜黃素抑制BGC-823/5-Fu集落形成能力

與對照組比較，姜黃素干預(yù)組、順鉑干預(yù)組、聯(lián)合干預(yù)組干預(yù)后24 h集落形成數(shù)減少(P<0.05)；且聯(lián)合干預(yù)組少于姜黃素干預(yù)組、順鉑干預(yù)組(P<0.05)；姜黃素干預(yù)組與順鉑干預(yù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

a：各組細(xì)胞集落形成情況；b：各組細(xì)胞集落計數(shù) *：與對照組比較，P<0.05；#：與姜黃素干預(yù)組比較，P<0.05；△：與順鉑干預(yù)組比較，P<0.05

2.3 姜黃素抑制BGC-823/5-Fu細(xì)胞遷移能力

與對照組比較，姜黃素干預(yù)組、順鉑干預(yù)組、聯(lián)合干預(yù)組干預(yù)后穿膜細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；且聯(lián)合干預(yù)組少于姜黃素干預(yù)組、順鉑干預(yù)組(P<0.05)，姜黃素干預(yù)組與順鉑干預(yù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.4 Wnt/β-catenin信號通路以及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

姜黃素干預(yù)組E-cadherin、Vimentin以及β-catenin蛋白表達(dá)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但GSK3β蛋白表達(dá)高于對照組，Wnt2蛋白表達(dá)低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

a：各組細(xì)胞遷移情況(×200)；b：各組細(xì)胞遷移計數(shù) *：與對照組比較，P<0.05；#：與姜黃素干預(yù)組比較，P<0.05；△：與順鉑干預(yù)組比較，P<0.05

順鉑干預(yù)組E-cadherin蛋白表達(dá)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但GSK3β蛋白表達(dá)高于對照組，Vimentin、Wnt2及β-catenin蛋白表達(dá)低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，聯(lián)合干預(yù)組E-cadherin、GSK3β蛋白表達(dá)增高，Wnt2、β-catenin及Vimentin蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合干預(yù)組Wnt2及β-catenin蛋白表達(dá)低于姜黃素干預(yù)組、順鉑干預(yù)組，GSK3β蛋白表達(dá)高于姜黃素干預(yù)組、順鉑干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合干預(yù)組Vimentin蛋白表達(dá)低于姜黃素干預(yù)組(P<0.05)，與順鉑干預(yù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合干預(yù)組E-cadherin蛋白表達(dá)與姜黃素干預(yù)組和順鉑干預(yù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

3 討論

對于臨床分期為T2～4N0～3M0且可行手術(shù)切除的胃癌患者，新輔助化療是目前美國綜合腫瘤網(wǎng)絡(luò)中心(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南推薦的首選治療策略[8]。順鉑是一種無機(jī)鉑劑，可誘導(dǎo)DNA-蛋白、鏈間和鏈內(nèi)DNA交聯(lián)，抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是進(jìn)展期胃癌新輔助化療方案的重要組成[9-10]。然而，由于腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性，順鉑的療效與發(fā)展受到了很大的限制。因此，亟需尋找增強化療藥物敏感性的方法，以提高療效。天然產(chǎn)物是目前公認(rèn)的最重要的生物活性物質(zhì)和藥物先導(dǎo)物來源。1981～2006年，73%的癌癥批準(zhǔn)藥物都是天然產(chǎn)品或是基于天然產(chǎn)品研發(fā)[11]。姜黃素作為姜黃屬植物中的主要活性成分，具有清除自由基、抗炎、抗氧化、抗癌、抗微生物等多方面藥理作用，在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)中應(yīng)用廣泛[12]。研究證實，姜黃素可通過多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[12-13]。除了在體內(nèi)外模型中觀察到的抗腫瘤活性，姜黃素單獨或與已批準(zhǔn)的其他抗癌藥物(如多西紫杉醇、奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶等)聯(lián)合使用，可發(fā)揮化學(xué)預(yù)防、減輕副作用以及增強化療藥物敏感性等多方面的作用[13]。

a：Western blot檢測相關(guān)蛋白結(jié)果；b：各組蛋白表達(dá)定量分析 *：與對照組比較，P<0.05；#：與姜黃素干預(yù)組比較，P<0.05；△：與順鉑干預(yù)組比較，P<0.05

本研究采用姜黃素聯(lián)合順鉑在體外干預(yù)5-Fu負(fù)荷誘導(dǎo)的多藥耐藥胃癌細(xì)胞株BGC-823/5-Fu，結(jié)果顯示，聯(lián)合干預(yù)組集落形成數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)較姜黃素干預(yù)組、順鉑干預(yù)組減少，說明與順鉑單藥干預(yù)相比，聯(lián)合給藥抑制細(xì)胞增殖及遷移的作用更強；與對照組比較，聯(lián)合干預(yù)組E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，Vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)，表現(xiàn)出抑制經(jīng)典的EMT標(biāo)志蛋白改變作用。EMT過程可促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，誘導(dǎo)干細(xì)胞特性，有助于誘導(dǎo)耐藥及免疫抑制，與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[14]。Huang等[15]在乳腺癌細(xì)胞EMT研究中發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L濃度的姜黃素干預(yù)能使脂多糖誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7重塑E-cadherin表達(dá)，下調(diào)Vimentin表達(dá)，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。與順鉑單獨使用相比，姜黃素與順鉑聯(lián)合使用能夠下調(diào)體內(nèi)外FEN1的表達(dá)，抑制受損堿基剔除和DNA的損傷修復(fù)，增強乳腺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[16]。在卵巢癌的研究中，Zhu等[17]的研究顯示，姜黃素與順鉑聯(lián)合化療具有顯著的協(xié)同作用，能夠有效下調(diào)Twist 1蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤活性。Twist 1是間質(zhì)表型的主要調(diào)控因子，與細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Twist 1轉(zhuǎn)錄激活下游效應(yīng)蛋白，抑制E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)EMT過程[18]。已有研究發(fā)現(xiàn)，EMT調(diào)控機(jī)制涉及Wnt/β-catenin等多種信號通路，異常激活的Wnt/β-catenin是促進(jìn)多種癌細(xì)胞增殖和藥物抗性的重要元兇[13,19]。因此，靶向Wnt/β-catenin的藥物可能成為多靶點聯(lián)合化療方案的重要組成。研究證實，姜黃素是Wnt信號的有效抑制劑[7,20]，姜黃素單藥或聯(lián)合干預(yù)均能下調(diào)胃癌細(xì)胞Wnt/β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄信號，上調(diào)下游分子鈣依賴性跨膜糖蛋白E-cadherin(具有抑制癌細(xì)胞向外侵襲的作用)的表達(dá)，本研究結(jié)果與之一致。這種抑制作用亦在A549、HCT116、MCF7、A375等多個癌細(xì)胞系中得到證實，研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素不僅能夠單獨作用，負(fù)性調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，抑制增殖，促進(jìn)凋亡，還能與槲皮素(天然活性物質(zhì))協(xié)同發(fā)揮作用[21]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合干預(yù)組OD值及Wnt2、β-catenin表達(dá)低于順鉑干預(yù)組，提示在多藥耐藥細(xì)胞株BGC-823/5-Fu的體外培養(yǎng)中，姜黃素聯(lián)合順鉑化療較單一順鉑化療具有更顯著的Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白抑制作用，Wnt/β-catenin信號失活進(jìn)而降低胃癌細(xì)胞活力與遷移能力。類似的化療增敏作用在姜黃素聯(lián)合5-Fu、順鉑的化療方案對人胃癌細(xì)胞株MGC-803的抗癌研究中得到證實，與單藥治療組相比，多藥聯(lián)合組胃癌細(xì)胞活力、集落形成和細(xì)胞遷移均顯著降低[22]。在頭頸部鱗癌的在體研究中，研究人員將脂質(zhì)體姜黃素與亞治療劑量順鉑靜脈注射到生長在異種移植瘤的裸鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，這兩種藥物協(xié)同作用，激活PPARγ受體(姜黃素抗癌的另一重要靶點)[20]，能有效抑制腫瘤生長，同時降低順鉑的毒副作用[23]。

值得關(guān)注的是，在姜黃素聯(lián)合化療藥物對Ph+急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的研究中，Santana-Bejarano等[24]發(fā)現(xiàn)，姜黃素的化學(xué)增敏效應(yīng)可能存在不同程度劑量和時間依賴的增效/協(xié)同作用。本研究參照文獻(xiàn)選擇低濃度進(jìn)行干預(yù)，關(guān)于姜黃素的濃度依賴性效應(yīng)未做比較。近年來，隨著納米封裝、膠束形成等制藥技術(shù)的應(yīng)用，姜黃素與Zn2+、Cu2+、Mg2+等金屬離子絡(luò)合可以提高姜黃素的生物利用度[13]。因此，姜黃素的最佳給藥濃度尚需結(jié)合給藥方式和藥物配伍等進(jìn)一步研究。

綜上所述，姜黃素通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路，增強多藥耐藥胃癌細(xì)胞株BGC-823/5-Fu對順鉑的敏感性，抑制胃癌細(xì)胞EMT過程。本研究將天然抗癌藥物與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，改進(jìn)了化學(xué)抗腫瘤治療方案，解決了化療過程中腫瘤細(xì)胞耐藥問題，為姜黃素應(yīng)用于胃癌的臨床治療提供了新的基礎(chǔ)。