李 娟，張 馨，王 雙，冉永紅，趙雅貞，郝玉徽

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系復(fù)合傷研究所，重慶 400038)

貧鈾(depleted uranium,DU)被認(rèn)為是一種新興的、具有放射性的環(huán)境污染物，其存在于土壤、巖石、地表水、地下水、空氣、植物和動(dòng)物中，并微量存在于食物和飲用水中，一定程度上影響著人們的健康[1-2]。預(yù)防和治療放射性核素?fù)p傷的措施主要包括限制放射性核素從污染部位吸收以及促進(jìn)其排泄[3]。目前已有研究合成了多種促排劑，并測(cè)試了其與DU螯合的適用性，但是其中許多促排劑顯示出較高的毒性[4]。放射性核素促排劑二乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentacetate,DTPA)的口服制劑被認(rèn)為是體內(nèi)螯合鈾的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其具有腎毒性、致畸性、胚胎毒性等副作用[4-5]。NaHCO3長(zhǎng)期以來(lái)都被用于螯合DU，具有較小的腎毒性，在體內(nèi)更穩(wěn)定，并且可以被腎迅速過(guò)濾，但NaHCO3的螯合效率低，且酸堿干擾高。由于核素促排等相關(guān)研究較少，新促排劑或螯合劑的研究發(fā)展緩慢，因此，探索安全有效的促排劑勢(shì)在必行。有研究發(fā)現(xiàn)，天然植物來(lái)源的多糖具有明顯的抗氧化、抗腫瘤、抗癌、抗細(xì)菌、抗炎、抗糖尿病和抗肥胖活性作用[6]。低分子柑橘果膠(low-molecular-weight citrus pectin,LCP)是通過(guò)規(guī)定的pH值和溫度水解天然果膠(C6H10O7)而得到的分子質(zhì)量較小、酯化度較低的果膠多糖[7-8]。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)LCP可有效抑制胃腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。楊國(guó)華等[10]發(fā)現(xiàn)LCP能抑制小鼠結(jié)腸癌的生長(zhǎng)、肝轉(zhuǎn)移及血管形成。關(guān)于LCP在醫(yī)學(xué)發(fā)展方面的潛能值得深入研究。因此，本研究將探索LCP對(duì)放射性核素內(nèi)污染的抗放與促排功效。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備與制備

昆明小鼠210只，雄性，體質(zhì)量(20±5)g，購(gòu)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；高活性小分子果膠(生產(chǎn)批號(hào):180810)由浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院和杭州絡(luò)通生物科技有限公司聯(lián)合開(kāi)發(fā)；過(guò)濾細(xì)菌后的DU溶液(2 mg/L)由陸軍軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)系提供；NaHCO3(分析純)購(gòu)于重慶博藝化學(xué)試劑有限公司；總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒(S0109)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；脂類過(guò)氧化作用[丙二醛(malondialdehyde，MDA)]檢測(cè)試劑盒(MAK085-1KT)購(gòu)于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；頗爾制水系統(tǒng)購(gòu)于頗爾(中國(guó))有限公司；MARS微波消解儀系統(tǒng)購(gòu)于CEM公司；MUA型微量鈾分析儀(編號(hào)：050302)購(gòu)于北京羽綸科技公司核工業(yè)北京地質(zhì)研究院分析測(cè)試研究中心；醫(yī)用1 mL注射器，滅菌手術(shù)剪，一次性醫(yī)用滅菌手套、帽子和口罩等耗材購(gòu)于國(guó)潤(rùn)平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)方案及流程見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)方案框架流程

1.2 果膠抗放存活實(shí)驗(yàn)

1.2.1 相同輻照劑量，不同果膠濃度 將60只昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、25 mg/kg果膠組、50 mg/kg果膠組、250 mg/kg果膠組，每組15只。對(duì)照組：前 5 d不做任何處理，5 d后以總劑量5.5 Gy輻照1次，速率為1.2 Gy/min。其余3組前5 d分別腹腔注射500 μL不同濃度(25 mg/kg、50 mg/kg、250 mg/kg)果膠溶液，每天1次；5 d后以總劑量5.5 Gy輻照1次，速率為1.2 Gy/min，輻照后腹腔注射500 μL不同濃度(25 mg/kg、50 mg/kg、250 mg/kg)果膠溶液，每天1次，連續(xù)5 d。每天記錄各組小鼠死亡狀況，直至30 d。

1.2.2 不同輻照劑量，相同果膠濃度 在篩選出有效果膠濃度后，把90只昆明小鼠隨機(jī)分為3 Gy對(duì)照組、5.5 Gy對(duì)照組、8 Gy對(duì)照組、3 Gy果膠組、5.5 Gy果膠組、8 Gy果膠組，每組15只。對(duì)照組：前5 d不做任何處理，5 d后分別以總劑量3 Gy、5.5 Gy、8 Gy輻照1次，速率均為1.2 Gy/min。果膠組：前5 d腹腔注射500 μL果膠溶液(25 mg/kg)，每天1次；5 d后分別以總劑量3 Gy、5.5 Gy、8 Gy輻照1次，速率均為1.2 Gy/min，輻照后腹腔注射500 μL果膠溶液(25 mg/kg)，每天1次，連續(xù)5 d。每天記錄各組小鼠死亡狀況，直至30 d。

1.3 果膠抗放實(shí)驗(yàn)

將20只昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、果膠組，每組10只。對(duì)照組：前5 d不做任何處理，5 d后以總劑量5.5 Gy輻照1次，速率為1.2 Gy/min。果膠組：前5 d腹腔注射500 μL果膠溶液(25 mg/kg)，每天1次；5 d后以總劑量5.5 Gy輻照，速率為1.2 Gy/min，輻照后腹腔注射500 μL果膠溶液(25 mg/kg)，每天1次，連續(xù)4 d。4 d后檢測(cè)小鼠血常規(guī)；取骨髓和腸組織進(jìn)行病理切片；取肝組織進(jìn)行SOD、MDA等氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 果膠促排實(shí)驗(yàn)

將40只昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、DU組、NaHCO3組、果膠組，每組10只。對(duì)照組：不做處理。DU組：3 mg/kg DU腹腔注射給藥1次。NaHCO3組：3 mg/kg DU腹腔注射給藥1次；1 h后腹腔注射500 μL 5%的NaHCO3，每天1次，連續(xù)4 d。果膠組：3 mg/kg DU腹腔注射給藥1次；1 h后腹腔注射500 μL果膠(25 mg/kg)，每天1次，連續(xù)4 d。DU染毒4 d后收集小鼠血清，檢測(cè)血清腎功能；取腎組織進(jìn)行病理切片并檢測(cè)腎鈾含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 果膠抗放存活率結(jié)果

在探究不同濃度果膠對(duì)小鼠存活率的影響時(shí)，50 mg/kg果膠組和250 mg/kg果膠組小鼠最終存活率均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；25 mg/kg果膠組小鼠最終存活率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。故后續(xù)研究采用最終存活率較高的25 mg/kg果膠濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探究此濃度下不同輻照劑量對(duì)小鼠存活率的影響，結(jié)果顯示，25 mg/kg果膠濃度下，3 Gy果膠組、5.5 Gy果膠組最終存活率均高于3 Gy對(duì)照組、5.5 Gy對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；8 Gy果膠組最終存活率與8 Gy對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。因此，25 mg/kg果膠可提高3 Gy和5.5 Gy輻照小鼠的最終存活率。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05

*：P<0.05

2.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

體外氧化應(yīng)激檢測(cè)結(jié)果顯示，果膠組MDA水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明對(duì)照組受自由基攻擊較果膠組嚴(yán)重；果膠組SOD活力高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明果膠組清除氧自由基的能力高于對(duì)照組(圖4)。

a:MDA；b:SOD活力 *：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.3 HE染色結(jié)果

腎組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組腎小管規(guī)則，幾乎沒(méi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維化(實(shí)質(zhì)化)；果膠組有炎性細(xì)胞，存在一定程度纖維化；DU組腎小管不規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較多，纖維化較嚴(yán)重；NaHCO3組有炎性細(xì)胞，存在一定程度纖維化(圖5)。

圖5 各組腎組織病理切片HE對(duì)比

骨髓切片觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠骨髓有大量紅細(xì)胞填充，果膠組紅細(xì)胞明顯減少，血管細(xì)胞、纖維細(xì)胞、骨髓細(xì)胞開(kāi)始再生(圖6)。

圖6 各組骨髓組織病理切片HE對(duì)比

腸組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠小腸絨毛短細(xì)，排列紊亂，上皮下間隙擴(kuò)張；果膠組小鼠腸黏膜形態(tài)排列規(guī)則，連續(xù)性完整，無(wú)充血及明顯斷裂現(xiàn)象(圖7)。

圖7 各組腸組織病理切片HE染色對(duì)比

2.4 血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)5.5 Gy輻照后，果膠組單核細(xì)胞比例高于對(duì)照組，差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其余外周各血象與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖8。

#：與對(duì)照組比較，P<0.01

2.5 血清腎功能檢測(cè)

注射DU后，果膠組和DU組肌酐及尿素含量均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，果膠組肌酐及尿素含量低于DU組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖9。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與果膠組比較，P<0.05

2.6 腎鈾含量檢測(cè)結(jié)果

注射DU后收集小鼠腎組織，經(jīng)微波消解后檢測(cè)其鈾含量，結(jié)果顯示，果膠組腎鈾含量低于DU組和NaHCO3組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明果膠能降低小鼠體內(nèi)腎鈾含量(圖10)。

*：果膠組與其他組比較，P<0.05

3 討論

鈾是一種放射性核素，DU是天然鈾濃縮過(guò)程的副產(chǎn)品[11]。DU及其化合物的放射毒性和化學(xué)毒性是引發(fā)肺癌和腎損傷的原因之一，其化學(xué)毒性可引起急性效應(yīng)[12]。DU可通過(guò)吸入、食入或皮膚接觸進(jìn)入人體[4]，在進(jìn)入人體后其化學(xué)結(jié)構(gòu)會(huì)隨溶液的pH值發(fā)生復(fù)雜變化，而且DU可與人體中的各種成分結(jié)合，短時(shí)間內(nèi)即可對(duì)各個(gè)器官造成嚴(yán)重?fù)p害[13]。雖然群體暴露于大量DU的可能性很小[12]，但是，由于對(duì)核燃料需求的增加，預(yù)計(jì)環(huán)境中的DU泄漏量也將增加[4]。臨床可以通過(guò)增加DU的消除量或減少其吸收量和分布來(lái)減少DU的積累。

螯合劑可治療重金屬中毒，使用螯合劑加速鈾從體內(nèi)排泄的螯合療法是降低鈾毒性的獨(dú)特方法[12]。螯合劑已被廣泛用于治療多種金屬的急性和慢性中毒，可溶性螯合劑的使用可減少DU在器官中的沉積并加速其消除，降低毒性[4]。甲基亞氨基二乙酸可以顯著降低DU注射部位的鈾濃度，并顯著加速鈾的排泄。Fukuda等[13]發(fā)現(xiàn)對(duì)受DU污染的傷口采用甲基亞氨基二乙酸局部治療可有效減少急性損傷。注射4 mg/kg DU(pH 1)后的120 min內(nèi)使用甲基亞氨基二乙酸，可降低尿液和糞便中的尿鈾含量及腎和骨骼中鈾的濃度。這與我們注射果膠排鈾效果類似。由于螯合劑在生理pH下的溶解度有限，對(duì)其形成螯合物的動(dòng)力學(xué)不利，因此，并非所有的化合物都適合用作治療全身性鈾中毒的螯合劑[12]。天然果膠因溶解度小、腸吸收困難而作用有限[14]，本研究采用修飾過(guò)的果膠LCP，克服了天然果膠分子質(zhì)量大、不易消化吸收等問(wèn)題，溶解度更好，且LCP的直鏈結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的陽(yáng)離子結(jié)合能力，靶向性較天然果膠更強(qiáng)[2]。

天然果膠作為一種膳食纖維，有抑制結(jié)腸癌、降血壓、減少腸道有害菌感染和腹瀉、改善動(dòng)脈粥樣硬化及心臟病等功效[10]。Edirisinghe等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，海洋來(lái)源的螺旋藻果膠可促進(jìn)體外人皮膚成纖維細(xì)胞遷移和增殖，且無(wú)任何細(xì)胞毒性作用；低劑量(50 μg/mL)的螺旋藻果膠可促進(jìn)斑馬魚(yú)截肢尾鰭再生，且沒(méi)有任何毒性；螺旋藻果膠(每條600 μg)可使斑馬魚(yú)的傷口快速愈合，且無(wú)過(guò)多瘢痕形成；暴露于螺旋藻果膠的成年斑馬魚(yú)可以實(shí)現(xiàn)損傷肌肉和腎的快速修復(fù)，與先前針對(duì)其他魚(yú)類和哺乳動(dòng)物傷口進(jìn)行的研究結(jié)果一致。本研究首次從抗輻射、促進(jìn)放射性物質(zhì)排出方面對(duì)果膠進(jìn)行分析，通過(guò)果膠抗放存活實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，濃度為25 mg/kg的果膠溶液可以明顯降低輻射后小鼠的病死率，且無(wú)明顯毒副作用，因此果膠具有成為全身性鈾中毒解毒劑的可能。

在研發(fā)新藥方面，一些研究者通過(guò)對(duì)天然殼聚糖進(jìn)行修飾來(lái)探索其應(yīng)用價(jià)值。Amirian等[16]基于氧化殼聚糖(oxidized chitosan,OC)和酰胺化果膠(amidated pectin,AP)構(gòu)建了原位交聯(lián)的可注射水凝膠。AP-OC水凝膠可以為細(xì)胞增殖提供更好的微環(huán)境，因?yàn)檫@兩種帶有氨基的改性天然多糖都可溶于中性溶液。由于其原位交聯(lián)、可調(diào)節(jié)的保水能力、良好的生物降解性以及生物相容性等綜合優(yōu)勢(shì)，AP-OC水凝膠在傷口敷料和皮膚組織工程中有良好的前景。張曉菲等[17]在印跡技術(shù)指導(dǎo)下合成了一系列水溶性交聯(lián)殼聚糖衍生物，其中五二醛交聯(lián)羧甲基殼聚糖可減少DU在細(xì)胞內(nèi)的積累，這可能是由于五二醛交聯(lián)羧甲基殼聚糖與DU形成的DU-殼聚糖衍生物的沉淀物體積較大而無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞，由此減少了細(xì)胞對(duì)DU的吸收，從而發(fā)揮解毒作用。本研究通過(guò)向DU小鼠模型注射果膠，發(fā)現(xiàn)果膠對(duì)腎、骨髓、小腸均具有保護(hù)作用，但是果膠保護(hù)機(jī)體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)果膠對(duì)輻射后的腸道具有保護(hù)作用，Sureban等[18]在研究飲食果膠對(duì)致死性全身γ-IR輻射誘導(dǎo)的腸道干細(xì)胞缺失、隱窩和總體存活影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，果膠可以防止電離輻射引起的潛在儲(chǔ)備腸道干細(xì)胞缺失，并促進(jìn)隱窩再生。也有學(xué)者在微生物降低鈾毒性機(jī)制方面展開(kāi)研究，Agarwal等[19]在高鈾環(huán)境下分離了數(shù)種細(xì)菌菌株，從蛋白質(zhì)組學(xué)水平上得到了該細(xì)菌生存在高鈾環(huán)境時(shí)新陳代謝和應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)數(shù)據(jù)，這些研究可以確定基因蛋白靶標(biāo)，測(cè)量并預(yù)測(cè)在歷史上受DU污染存活下來(lái)的生物自主修復(fù)的信號(hào)通路。

綜上所述，本研究初步探索了果膠對(duì)核素內(nèi)污染小鼠的防護(hù)作用，證實(shí)了果膠具有抗輻射與促進(jìn)DU排出的功效，但是果膠的抗輻射及促排機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。