王 麗,陳 炎,于 超,任喜東*,劉新利*

1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,濟南 250353 2.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 微生物工程重點實驗室,濟南 250353

目前已有超過2萬種具有生物活性的微生物次級代謝產物[1],微生物次級代謝物主要包括抗生素[2]、色素、毒素、生態(tài)競爭和共生效應物、信息素、酶抑制劑、免疫調節(jié)劑、受體拮抗劑、殺蟲劑、抗腫瘤制劑和動植物生長促進劑等,次級代謝產物常常在不同生物體的防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,被廣泛應用于農業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥健康行業(yè)[3-6],對人類的生產生活至關重要。微生物次級代謝產物正在發(fā)揮越來越重要的作用,提升微生物次級代謝產物產量成為熱門研究領域。

微生物次級代謝產物的形成受到營養(yǎng)物質、生長速率、反饋控制、酶失活和酶誘導的調節(jié)[7],開發(fā)高產次級代謝產物菌株的遺傳方法不斷出現(xiàn),突變和基因重組等互補技術的結合能夠使許多初級和次級代謝物以及蛋白質生物制藥和酶的產量顯著提高[8],已被證明成功的有代謝工程、核糖體工程、組合生物合成和分子育種技術。面對市場日益增長的微生物次級代謝產物的需求,發(fā)掘提高微生物發(fā)酵中次級代謝產物產量的新策略是十分必要的。研究表明,酸性和堿性pH沖擊[9](短時pH脅迫)、溫度脅迫、鹽脅迫以及氧化脅迫等都能夠提高微生物次級代謝產物的產量。微生物發(fā)酵過程中,pH作為發(fā)酵過程關鍵因素之一,對微生物生長和產物積累有較大影響。當微生物生長環(huán)境的pH與其最適pH有較大偏差時,會導致pH脅迫的產生,pH脅迫作為一種發(fā)酵策略已被廣泛接受,并成功地用于改善微生物次級代謝產物產量。研究pH脅迫對微生物合成次級代謝產物的影響并揭示相關的作用機制,有助于發(fā)酵生產工藝的改進和菌種的定向改造,對提高微生物發(fā)酵中次級代謝產物產量具有十分重要的意義。

本文的目的是總結pH脅迫策略在微生物發(fā)酵領域的優(yōu)勢,它不僅可以增強微生物對外界pH脅迫的耐受性,還可以提高微生物的次級代謝產物合成能力。將pH脅迫作為環(huán)境壓力對微生物進行適應性進化,可以使微生物發(fā)生基因水平的突變,提高微生物的脅迫耐受性和次級代謝產物的合成能力,進一步開拓pH脅迫在微生物育種方面的應用。

1 微生物對pH脅迫的響應

當微生物在脅迫環(huán)境下,自身生理應激機制會及時響應,以適應在逆境下帶來的生長壓力[10]。pH脅迫作為一種環(huán)境信號,通過一系列信號轉導系統(tǒng)傳遞啟動相關基因的轉錄,刺激微生物應答機制的產生。

1.1 微生物信號轉導系統(tǒng)對 pH脅迫的響應

微生物利用復雜的調節(jié)網(wǎng)絡對環(huán)境刺激或脅迫(如營養(yǎng)缺乏、鹽休克、氧化應激、滲透應激、酸性脅迫和堿性脅迫)作出反應。當細胞膜受到外界環(huán)境的刺激時,細胞壁接收到的應激信號通過信號轉導系統(tǒng)的作用穿過細胞膜進入細胞內空間,引起相關基因的轉錄和表達,從而響應外界的環(huán)境刺激。細菌主要利用兩種信號轉導系統(tǒng)來感知和響應環(huán)境脅迫:雙組分系統(tǒng)(TCS)和胞外功能(ECF)σ因子。這兩種系統(tǒng)在功能上是相似的,因為它們通常通過膜蛋白(傳感器激酶或抗σ因子)作為壓力傳感器和轉錄因子(響應調節(jié)器或σ因子)來調節(jié)基因表達。

pH脅迫作為一種環(huán)境信號,可以通過一系列信號轉導系統(tǒng)傳遞至細胞激起應答機制,TCSs和σ因子[11]是信號轉導的組成部分,pH沖擊后,TCSs和σ因子發(fā)生不同程度的轉錄或表達差異。PAN等[12]在pH沖擊后發(fā)現(xiàn)6個與信號轉導途徑相關的基因(mprA、mprB、pepD、desK、desR、sigE)上調,基因回補和過表達表明mprA、mprB和pepD對pls(ε-聚賴氨酸合成酶基因)有正調控作用。在MO等[13]的一項研究中,酸性pH沖擊后TCSs中CseC/CseB和VanS/VanR的轉錄大幅上調,這兩種TCSs與抗細胞壁水解的自我保護密切相關。JIANG等[14]發(fā)現(xiàn)S.hygroscopicus5008在受到堿性pH沖擊后,細胞壁接收到的脅迫信號通過雙組分系統(tǒng)傳導,并調控(ECF) σ因子,從而引起下游基因的轉錄,激活細胞防御系統(tǒng)。

不同的σ因子對應不同類型的環(huán)境脅迫,σ因子協(xié)調基因表達,以響應各種環(huán)境和內源性信號,通過激活與次級代謝物生物合成相關的基因,在次級代謝物的合成中發(fā)揮重要作用。已有研究表明,分枝桿菌的σ因子SigF和鼠傷寒沙門氏菌的RpoS是耐受酸性pH脅迫所必需的。為了深入研究pH沖擊對σ因子的影響,KIM等[15]對pH沖擊后S.coelicolorA3(2)中所有σ因子的轉錄水平進行了分析,pH沖擊后多達43個σ因子的轉錄上調,與放線菌素合成相關的σ因子基因如sigH、sigR、sigG、sigB、hrdD和hrdB都產生不同程度的上調。其中,HrdD可以識別actII-orf4的啟動子,該啟動子可調節(jié)放線菌素的產生。

1.2 微生物次級代謝產物合成途徑對pH脅迫的響應

pH沖擊作為環(huán)境脅迫的一種,已經被多次應用于提高發(fā)酵過程中次級代謝產物的產量。表1對pH脅迫下微生物發(fā)酵中次級代謝產物產量提升的相關典型案例進行了總結。微生物次級代謝產物的合成途徑是十分復雜的,其合成酶受多種調控因子的影響,pH脅迫對微生物發(fā)酵產生的影響最終體現(xiàn)在合成酶和調控因子基因的轉錄和表達上。PAN等[16]發(fā)現(xiàn),pH沖擊后S.albulus M-Z18的ε-聚賴氨酸合成酶的轉錄水平和酶活力水平都得到顯著提升。KIM等[15]對S.coelicolorA3(2)進行酸性pH沖擊后,放線菌素合成與分泌明顯提高,研究發(fā)現(xiàn),pH沖擊后4個參與放線菌素生物合成的調控因子基因pkaG、afsR、afsS和actII-orf4的轉錄更早上調,而且pH沖擊顯著增強了放線菌素生物合成基因簇的轉錄。在另外一項研究中,JIANG等[17]發(fā)現(xiàn),pH沖擊后S.hygroscopicus5008表達差異顯著的基因主要負責代謝、信號傳導、以及信息存儲和處理,且大多數(shù)井岡霉素生物合成基因的轉錄水平得到加強；與代謝相關的表達差異顯著的基因中負責編碼細胞膜上陽離子轉運atp酶的轉錄上調,有利于營養(yǎng)吸收和次級代謝產物的分泌。此外,MO等[18]發(fā)現(xiàn)pH沖擊后轉錄激活因子redD的轉錄水平增加,redD轉錄增強與S.coelicolor M511的十一烷基靈菌紅素產量增加一致。pH沖擊上調了微生物次級代謝產物調控因子的表達,激活微生物次級代謝途徑中沉默的基因簇,使之轉錄和表達,提高次級代謝途徑的代謝活性。

表1 pH脅迫對微生物次級代謝產物產量的影響 %

2 適應性進化對微生物的影響

短期環(huán)境脅迫增強微生物對環(huán)境脅迫的耐受性,提高微生物合成次級代謝產物的能力,相關基因和轉錄因子的表達也大幅上調。但是短期環(huán)境脅迫中微生物發(fā)生的僅僅是表型上的變化,基因型并沒有發(fā)生變化。上文提到pH沖擊作為一種特殊的短期環(huán)境脅迫可以提高微生物的菌體活性及合成次級代謝產物的能力,pH沖擊后,微生物的基因型并沒有發(fā)生變化,發(fā)生的表型變化并不具備遺傳能力,傳代培養(yǎng)后菌體又恢復至原有的性狀[18]。長期的環(huán)境脅迫可以使微生物發(fā)生基因突變,這使通過環(huán)境脅迫改造微生物成為可能。

適應性實驗室進化是生物學研究中常用的一種方法,旨在深入了解在特定生長條件下,微生物種群在長期選擇過程中積累的分子進化的基本機制和適應性變化[19]。pH適應性進化即通過施加外源pH壓力對微生物造成脅迫,促使微生物發(fā)生突變,通過篩選,使得適應環(huán)境的突變得以保存且繼續(xù)突變,從基因水平提高微生物對于環(huán)境脅迫的耐受性以及發(fā)酵能力(圖1介紹了適應性實驗室進化的基本流程)。適應性實驗室進化相對于合理的工程策略和特定酶的定向修飾,優(yōu)勢在于讓許多不同的基因和調控區(qū)域同時發(fā)生非直覺的有益突變[20],這為改造微生物提供了更多的可能。pH適應性進化在微生物發(fā)酵上的應用主要體現(xiàn)在提升微生物對環(huán)境脅迫的耐受性和提高發(fā)酵產物合成能力上。

2.1 pH適應性進化提高微生物耐受性

當微生物處于一定的脅迫壓力下,如生物分子脅迫、非生物分子脅迫或特定的抑制劑等,細胞就會做出應激反應,從而導致細胞結構和生理特性的變化以及代謝失調的產生,最終使得菌株生長受到明顯的抑制。目前的研究表明,適應性實驗室進化技術能夠克服上述不利影響,從而增加工業(yè)或實驗室中有價值的菌株在脅迫環(huán)境下的耐受性和穩(wěn)定性[21]。表2對pH脅迫適應性進化提高微生物耐受性的相關典型案例進行了總結。適應性進化技術為我們了解微生物菌株的耐受機制以及構建更健壯的微生物菌株提供了一個新的思路。

表2 pH脅迫適應性進化提高微生物耐受性

2.2 pH適應性進化提高微生物次級代謝產物合成能力

目前,適應性進化的研究主要集中在提升微生物對于脅迫的耐受性,通過適應性進化策略提高微生物次級代謝產物合成能力的研究甚少。SONG等[22]采用低溫適應性實驗室進化技術,通過提高膜通透性來提高GlarealozoyensisC的肺炎球菌素B0生產能力。進化菌株(ALE50)的肺炎球菌素B0產量達到2.131 g/L,比起始菌株(ALE0)高出32%。此外,JIANG等[23]建立了常壓室溫等離子體物理誘變(ARTP)和H2O2驅動的適應性進化的組合策略。通過多輪ARTP和H2O2的交叉處理,搖瓶中蝦青素的產量達到65.9 mg/L,與起始菌株相比,增加了近4倍。在另一項研究,WANG等[24]通過適應性進化獲得了一株利用甘油生產高透明度、低粘度黃原膠的突變株,黃原膠產量達到11.0 g/L。研究發(fā)現(xiàn),進化菌株中與甘油代謝相關的基因(glpF、glpK、glpD和fbp)的轉錄水平均高于起始菌株。適應性進化不僅可以獲得突變株,通過與高通量DNA測序及適當?shù)纳镄畔W工具相結合,可以為接下來的基因工程提供新思路。

目前,ε-聚賴氨酸的產生菌主要為鏈霉菌,其最適的生長pH偏中性。然而,在ε-聚賴氨酸的生物合成過程中產生菌則面臨著自發(fā)酸脅迫:隨著發(fā)酵過程的進行,環(huán)境pH最終自發(fā)下降到3.0左右；而且,ε-聚賴氨酸合成的最適pH(pH 4.0)對產生菌而言也是一種酸脅迫環(huán)境。酸脅迫會引起胞內pH的下降,導致一些對酸敏感的酶失活、造成細胞膜和胞內大分子的結構損傷,最終引起細胞的死亡。因此,提高ε-聚賴氨酸產生菌的酸耐受性,有助于提高ε-聚賴氨酸的發(fā)酵產量。REN等[25]將從土壤中篩選到的S.diastatochromogenesT17為起始菌株,對其進行酸性適應性進化,得到耐酸性能提高的進化菌株AE44、AE51以及AE56。與原始菌株T17相比,進化菌株在低pH條件下生長速度更快,產孢能力更強,菌體干重分別提高了32%、40%和60%(圖2)。搖瓶發(fā)酵中,AE44、AE51和AE56的ε-PL產量較原始菌株分別提高了48.98%、71.43%和95.92%,進化菌株傳代培養(yǎng)6代后,發(fā)酵能力沒有退化,證明了進化菌株的遺傳性能穩(wěn)定(未發(fā)表數(shù)據(jù))。該研究表明,通過pH適應性進化從基因層次上提高微生物合成次級代謝產物的能力是可行的。

將pH適應性進化應用到提高微生物次級代謝產物合成能力領域中,將進一步拓展pH脅迫在微生物發(fā)酵和育種方面的作用。通過高通量DNA測序與適當?shù)纳镄畔W工具對pH適應性進化產生的突變進行識別,通過基因工程將所需的突變引入到感興趣的菌株中,從而進行因果決定或表型改變,將為分子育種技術提供新的方向。

3 總 結

pH脅迫作為一種環(huán)境應激源,對工業(yè)微生物的生產和性能有重要影響,在發(fā)酵生物技術中具有廣闊的應用前景。本文較為系統(tǒng)地綜述了pH脅迫策略在微生物發(fā)酵過程中產生的影響,提高微生物菌體活性和微生物合成次級代謝產物的能力。此外,本文還詳細介紹了pH適應性進化提高微生物耐受性以及其他適應性進化提高微生物發(fā)酵中次級代謝產物合成的研究。

將pH適應性進化應用到提高微生物刺激代謝產物合成能力這一領域中,將進一步拓展pH脅迫在微生物發(fā)酵和育種方面的作用。伴隨著DNA測序、生物信息學和基因工程等技術的飛速發(fā)展,pH適應性進化所帶來的非直覺的有益突變,將為分子育種技術提供新的靶點和方向。我們相信,pH適應性進化一定會在提升微生物次級代謝產物合成能力這一領域發(fā)揮積極的作用。