韓 偉， 魏豐賢， 張有成

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 普通外科， 蘭州 730030

原發(fā)性肝癌是全球尤其我國(guó)癌癥死亡的主要原因之一，總生存率僅為12.1%[1-2]。手術(shù)治療目前仍是肝癌治療的首選方案，但臨床中往往面臨早期確診率低，大部分就診患者存在肝內(nèi)乃至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，導(dǎo)致長(zhǎng)期生存率較低[3]?？傮w而言，肝癌侵襲性強(qiáng)相關(guān)的早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者生存率差的最主要原因，因此侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)通路一直是肝癌臨床轉(zhuǎn)化研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。

甲胎蛋白(AFP)目前仍是臨床工作中肝癌診斷、預(yù)后和隨訪監(jiān)測(cè)的重要標(biāo)記[4-5]。AFP在肝癌中表現(xiàn)出多種生物活性，前期研究發(fā)現(xiàn)用合成AFP小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，靶向沉默AFP基因的表達(dá)可以抑制肝癌Huh7細(xì)胞的增殖，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的早期凋亡[6]，但是目前關(guān)于AFP與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系及機(jī)制尚不完全清楚，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)沉默AFP基因在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，觀察其對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的作用，以及探討其相關(guān)機(jī)制，為肝癌相關(guān)侵襲和轉(zhuǎn)移的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供一定支持。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞生物研究所)，PMI1640培養(yǎng)基(HyClone公司)，胎牛血清(HyClone公司)，AFP siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司)，Trizol，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，紅色熒光標(biāo)記的寡核苷酸(Invitrogen公司)，AFP ELISA檢測(cè)試劑盒(上海西塘公司)，Transwell小室(Millipore公司)，Matrigel(BD Biosciences公司)，AFP一抗(北京博奧森公司)，vimentin (Sigma-Aldrich公司)，AKT，p-AKT，N-cadherin，E-cadherin(美國(guó)CST公司)，GAPDH一抗(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 HepG2細(xì)胞接種于6孔板，無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分為空白對(duì)照組(不做任何處理)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性siRNA)和AFP siRNA組(轉(zhuǎn)染AFP siRNA)。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 AFP siRNA正義鏈序列：5′-AAUUGCAGUCAAUGCAUCUUUCACC-3′，反義鏈序列5′-GGUGAAAGAUGCAUUGACUGCAAUU-3′，按照確定的最佳轉(zhuǎn)染條件，在6孔板中加入無(wú)血清培養(yǎng)基500 μl、AFP siRNA/陰性對(duì)照siRNA 10 nM/L以及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑5 μl混勻后室溫靜置15 min。取已計(jì)數(shù)并稀釋的HepG2細(xì)胞2.5 ml(細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×105/ml)分別加入6孔板中，晃動(dòng)培養(yǎng)板5 min并輕輕混勻后，恒溫(37 ℃，5% CO2)溫箱中孵育24 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。之后棄用混合液后加入含血清的1640培養(yǎng)基(1 ml)后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)AFP基因的相對(duì)表達(dá)量 提取各組細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作得到cDNA。qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中AFP的表達(dá)，引物序列為正義鏈5′-GGAAGTCTGCTTTGCTGAAGA-3′和反義鏈5′-CACACCGAATGAAAGACTCGT-3′, β-actin正義鏈5′-GCAAGCAGGAGTATGACGAGT-3′和反義鏈5′-GCAAGCAGGAGTATGACGAGT-3′。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s循環(huán)40次，72 ℃ 30 s退火，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，2-ΔΔCt法對(duì)AFP mRNA的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中AFP的表達(dá)量 各組干預(yù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞上清液后進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。將酶聯(lián)免疫儀設(shè)置采集450波長(zhǎng)處各孔的吸光度值，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組中AFP的含量，并重復(fù)3次。

1.2.5 遷移實(shí)驗(yàn) Transwell上室加入干預(yù)后細(xì)胞100 μl(細(xì)胞數(shù)為2×104，培養(yǎng)基不含血清)，下室加入完全細(xì)胞培養(yǎng)基750 μl，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，取出上室，固定后染色、漂洗并風(fēng)干，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量(200倍鏡下，隨機(jī)5個(gè)視野，取其平均值，均重復(fù)3次)。

1.2.6 侵襲實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)過(guò)干預(yù)的細(xì)胞100 μl(細(xì)胞數(shù)為2×104)加入Transwell上室(用稀釋的Matrigel膠包被)，每孔下室加入完全細(xì)胞培養(yǎng)基750 μl，余實(shí)驗(yàn)同上，并都重復(fù)3次。

1.2.7 Western blotting法測(cè)侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)量

按蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取HepG2細(xì)胞中Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、AKT和p-AKT蛋白。行SDS-PAGE分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法印跡到PVDF膜上，使用脫脂奶粉封閉1 h。分別加入vimentin、N-cadherin、E-cadherin、AKT及p-AKT等一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3遍。然后加入二抗后室溫孵育1 h，TBST漂洗3遍達(dá)30 min。ECL試劑盒顯影后凝膠成像儀顯像，所得條帶灰度掃描后行相對(duì)定量分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率 在siRNA為15 nmol/L、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑為5 μl/3 ml和細(xì)胞數(shù)為1×105/ml的體系下，24 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80%以上(圖1)。

注：a,普通光鏡視野下所見(jiàn)；b,熒光顯微鏡同一視野下所見(jiàn)。

2.2 AFP siRNA沉默效率檢測(cè) 通過(guò)qRT-PCR及ELISA檢測(cè)AFP mRNA和蛋白表達(dá)變化。與空白對(duì)照組相比，AFP siRNA組中AFP mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，抑制率達(dá)86.440%(表1)；與空白對(duì)照組相比，AFP siRNA組細(xì)胞上清液中AFP蛋白表達(dá)水平降低了85.590%，為(33.930±11.690) ng/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1)。上述結(jié)果表明，AFP siRNA能夠顯著抑制HCC HepG2細(xì)胞中AFP的表達(dá)。

2.3 沉默AFP基因能夠抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，AFP siRNA組在Transwell小室的穿膜細(xì)胞數(shù)下降(P<0.01)(表1)。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，AFP siRNA干預(yù)組細(xì)胞在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中的穿膜細(xì)胞數(shù)下降(P<0.01)(表1)。結(jié)果表明，沉默AFP后，細(xì)胞的遷移、侵襲能力均被明顯抑制(圖2)。

表1 沉默AFP在mRNA、蛋白水平表達(dá)以及肝癌HepG2細(xì)胞穿膜細(xì)胞率的變化

圖2 沉默AFP對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞縱向遷移和侵襲能力的影響

2.4 沉默AFP基因?qū)epG2細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白的影響 Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組肝癌HepG2細(xì)胞在處理48 h后，與空白對(duì)照組相比，AFP siRNA組Vimentin和N-cadherin的蛋白的表達(dá)明顯降低(P值均<0.05)，而E-cadherin的表達(dá)水平升高(P<0.01)(圖3，表2)。

圖3 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中AFP及EMT相關(guān)

2.5 沉默AFP基因?qū)Ω伟〩epG2細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的影響 HepG2細(xì)胞在AFP siRNA組轉(zhuǎn)染48 h后，與空白對(duì)照組相比，AFP siRNA組細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-AKT的表達(dá)被明顯抑制(P<0.01)(表2，圖4)。

圖4 AKT和p-AKT在蛋白水平的表達(dá)

表2 各組細(xì)胞AFP、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

AFP作為一種診斷HCC的重要的血清學(xué)標(biāo)志物[7]，研究[8-9]表明其與肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。AFP被報(bào)道同時(shí)參與了細(xì)胞內(nèi)重要的病理生理過(guò)程，例如腫瘤發(fā)生、分化及生長(zhǎng)等[10]。此外，AFP可以通過(guò)PI3K/AKT、p53/Bax/cytochrome c/caspase-3和JAK2/STAT3等轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[6，11-13],說(shuō)明AFP也參與到細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生等過(guò)程[14]。因此，AFP不但是一種肝癌伴隨的腫瘤相關(guān)抗原，而且在其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中也起著重要的作用。然而，AFP在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中的確切作用和機(jī)制尚不清楚。在本研究中，初步通過(guò)在HepG2細(xì)胞株中使用 siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染來(lái)沉默AFP基因，能使AFP的表達(dá)顯著降低，繼而觀察到細(xì)胞的遷移及侵襲性顯著下降。此外，抑制AFP的表達(dá)后表現(xiàn)出EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一種涉及多個(gè)基因的復(fù)雜過(guò)程，向外周侵襲是促成轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[14]。EMT在促成腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，包括細(xì)胞黏附素的喪失，細(xì)胞骨架成分的喪失、基因表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)的改變[15-16]，其中N-cadherin和Vimentin被認(rèn)為是最為關(guān)鍵的分子之一，已被發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)HCC發(fā)生轉(zhuǎn)移[17]。E-cadherin的表達(dá)降低、Vimentin和N-cadherin的表達(dá)升高是EMT加速腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[18]。本研究中，用AFP siRNA轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞細(xì)胞系HepG2可導(dǎo)致E-cadherin的上調(diào)和Vimentin、N-cadherin蛋白的降低，從而抑制EMT的過(guò)程。

在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路中，PI3K/Akt信號(hào)通路被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路[19-20]，在肝癌中可觀察到該通路的異?；罨痆21]。研究[22]表明，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路會(huì)降低N-cadherin、Vimentin的表達(dá)，增加EMT中上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，并與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程的EMT相互影響。然而，AFP是如何通過(guò)肝癌中的PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控腫瘤侵襲的機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)沉默AFP的表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)p-Akt的表達(dá)受到抑制，從而導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路的中斷，這表明沉默AFP可能通過(guò)阻斷PI3K/Akt通路抑制EMT的過(guò)程，進(jìn)而抑制肝癌的侵襲過(guò)程。目前常用的肝癌細(xì)胞株較多，本研究?jī)H在最為常用的人HepG2細(xì)胞中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，限于不同細(xì)胞株的特性，其他肝癌細(xì)胞內(nèi)的變化情況尚需進(jìn)一步研究論證。

綜上所述，AFP在肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵性的作用。沉默AFP可能通過(guò)阻斷PI3K/Akt通路抑制HepG2細(xì)胞EMT的過(guò)程,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的能力。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：韓偉負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，資料分析，撰寫(xiě)論文；魏豐賢參與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，修改論文；張有成負(fù)責(zé)擬定課題設(shè)計(jì)和寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。