劉明君， 劉穎娟， 楊 桂， 劉松梅

武漢大學中南醫(yī)院 檢驗科/基因診斷中心/檢驗系， 武漢 430071

肝細胞癌(HCC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其惡性程度高，增殖能力強，患者預后差。2018年，全球新發(fā)肝癌84.1萬例，在惡性腫瘤發(fā)病率排名第6位，死亡78.1萬例[1]；2015年我國的新發(fā)肝癌約37.0萬例，死亡人數(shù)約32.6萬例[2]。因此，尋找肝癌預后評估的生物標志物具有重要的臨床意義。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD是參與磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)的第一種酶，也是PPP的限速酶，糖酵解產(chǎn)生的6-磷酸葡萄糖在G6PD的催化下進入PPP，產(chǎn)生細胞活動所需要的能量[3]。研究發(fā)現(xiàn)，G6PD在黑色素瘤[4]、乳腺癌[5]、肺癌[6-7]、肝癌[8-9]、結直腸癌[10]等惡性腫瘤中表達升高，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

淋巴細胞/單核細胞比值(LMR)是反映機體炎癥和免疫狀態(tài)的一項敏感指標，已被證實可用于預測卵巢癌[11]、肺癌[12]和肝癌[13]等實體腫瘤的預后。本文通過分析G6PD在肝癌組織中的表達與預后的關系，以及不同G6PD表達水平患者的臨床指標差異，探討G6PD表達在HCC預后評估中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2016年6月—2018年1月在本院就診的44例首診HCC患者的肝癌組織和相應的癌旁組織標本，及其臨床信息和實驗室檢查結果。納入標準：(1)所有患者均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[14]；(2)有完整的基本資料和實驗室檢測結果(肝腎功能、血常規(guī)、凝血指標和腫瘤標志物)。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤或有全身感染癥狀；(2)術前接受過其他方式治療。

1.2 儀器試劑 采用貝克曼奧林巴斯5800 全自動生化分析儀檢測肝腎功能，貝克曼庫爾特全自動血細胞分析儀H750檢測血常規(guī)。貝克曼ACLTOP檢測凝血指標。BeckmanDX1800全自動化學發(fā)光儀測定AFP。BIO-RAD熒光定量 PCR系統(tǒng)CFX ConnectTM檢測基因表達。

1.3 方法 使用Trizol(美國Thermo公司)提取組織RNA。逆轉錄試劑盒FSQ-301(日本TOYOBO公司)合成cDNA。β-actin為內(nèi)參基因,進行qPCR。G6PD：上游5′-AACATCGCCTGCGTTATCCTC-3′,下游5′-ACGTCCCGGATGATCCCAA-3′；β-actin：上游5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3′,下游5′-GGATCTTCATGAGGTAGTC AGTC-3′。

用Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)數(shù)據(jù)庫分析G6PD在HCC組織中的表達。Kaplan Meier Plotter(KM plotter)數(shù)據(jù)庫評估HCC組織中G6PD表達水平與預后。

1.4 倫理學審查 本研究方案經(jīng)由武漢大學中南醫(yī)院倫理委員會審批，批號： 2017058。

2 結果

2.1 肝癌組織中G6PD mRNA表達 運用RT-qPCR檢測44例HCC患者肝癌組織和癌旁肝臟組織中G6PD的mRNA表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，G6PD mRNA在癌組織中表達明顯高于癌旁組織(Z=-3.221，P=0.001)，癌組織G6PD表達水平是癌旁組織的2.09倍(圖1a)。

注：a， HCC患者癌組織和癌旁組織G6PD mRNA表達水平比較；b，GEPIA數(shù)據(jù)庫中G6PD在肝癌組織中表達；c，G6PD高表達和低表達患者總生存曲線；d，G6PD高表達和低表達患者無進展生存曲線。

2.2 低G6PD組和高G6PD組的HCC患者基本資料 根據(jù)G6PD mRNA表達水平中位數(shù)，將患者分為G6PD高表達組(n=22)及低表達組(n=22)。兩組患者在年齡、性別、HBV DNA檢測陽性率和TNM分期上差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表1)。

2.3 肝癌患者預后與G6PD表達的關系分析 運用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析肝癌組織(n=369)和癌旁組織(n=160)中的G6PD表達。結果發(fā)現(xiàn)，G6PD在癌組織中表達明顯高于癌旁組織(P<0.01)(圖1b)。運用KM plotter數(shù)據(jù)庫，分析兩組患者預后差異。結果發(fā)現(xiàn)，G6PD高表達是不良預后的危險因素：總生存期(HR=1.84，95%CI： 1.30～2.61;P=0.000 52)和無進展生存期(HR=1.75，95%CI： 1.27～2.42；P=0.000 54)，即G6PD高表達患者預后不良(圖1c、d)。

2.4 肝癌組織中G6PD表達與臨床指標的關系 為了進一步比較肝癌患者中G6PD mRNA表達與臨床指標的關系，比較HCC患者低G6PD組(n=22)和高G6PD組(n=22)的肝功能、血常規(guī)、凝血功能和AFP差異。

結果顯示，LMR在高G6PD組患者中明顯低于低G6PD組(P=0.011)，其他指標兩組間差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表2)。

表2 肝癌患者G6PD表達水平與術前臨床指標關系

2.5 G6PD表達與LMR相關性分析 進一步分析G6PD mRNA表達量與LMR相關性，結果顯示G6PD表達水平與LMR呈負相關(r=-0.439,P=0.005)(圖2), 提示G6PD表達與免疫功能、炎癥狀態(tài)有關。

圖2 G6PD mRNA表達與LMR相關性

3 討論

HCC是一種進展迅速，惡性程度高，預后極差的腫瘤[15]。隨著各種分子生物學層面的研究深入，越來越多的研究表明肝癌的發(fā)生發(fā)展常伴隨著糖代謝紊亂[16]、多種基因表達改變和信號通路異常[17]。

腫瘤細胞由于瓦伯格效應(Warburg effect)主要通過糖酵解的方式分解葡萄糖獲能，所產(chǎn)生的6-磷酸葡萄糖可以通過PPP為核苷酸、脂質等生物分子合成提供前體以及NADPH[16,18]。本研究發(fā)現(xiàn)G6PD基因在HCC中表達明顯高于配對癌旁組織。相關研究指出，PI3K/Akt、Ras和Src等促癌信號通路的過度激活，可通過翻譯后調(diào)控機制促進G6PD激活[3]，從而引起腫瘤組織中G6PD表達升高，產(chǎn)生的高水平NADPH可以減少細胞活性氧(ROS)的生成[19]。ROS在多種癌癥中被檢測到，一方面被認為可以激活腫瘤信號，但同時ROS累積也能啟動氧化應激誘導腫瘤細胞的死亡，腫瘤細胞G6PD表達升高，可以減少升高的ROS，建立氧化還原平衡[20]。同時細胞內(nèi)ROS累積會引起NF-κB的激活，可引起大量細胞因子如IL-6、IL-24、IL-32等的釋放，細胞因子招募單核細胞、巨噬細胞到腫瘤部位，引起腫瘤微環(huán)境炎癥反應，促進腫瘤發(fā)展[21]。

已經(jīng)有研究證實HBV感染會引起G6PD的升高[22]，同時HBV感染可能會引起腫瘤微環(huán)境炎癥反應，引起免疫細胞數(shù)量和狀態(tài)改變[23]。而高LMR是多種癌癥預后的保護因素[9,24]，在肝癌的相關研究[25]中，肝癌術前LMR可分為高值組(≥3.03)和低值組(<3.03)，高LMR組患者肝癌切除術后5年生存率較好。也有學者[26]指出肝移植術后LMR<2.75的患者的5年生存率明顯低于LMR≥2.75的患者。而本研究發(fā)現(xiàn)LMR在G6PD高表達組中明顯低于G6PD低表達組，且肝癌組織中G6PD表達水平與LMR呈負相關，提示G6PD高表達的HCC患者不良預后可能與腫瘤微環(huán)境炎癥有關。

綜上，在肝癌組織中高G6PD的表達與不良預后有關，G6PD高表達和低表達組的LMR有明顯差異，且G6PD的表達量與LMR呈負相關，提示G6PD表達可能與腫瘤微環(huán)境炎癥反應有關。本研究所用樣本量較小，具體的分子機制尚需進一步研究。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：劉明君負責實驗和數(shù)據(jù)分析，撰寫論文； 劉穎娟參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；楊桂、劉松梅負責課題設計，指導撰寫文章并最后定稿。