韓 霞， 云 升

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室， 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 干細(xì)胞研究中心， 呼和浩特 010050

肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，引起肝硬化的病因有很多，歐美國家以酒精性肝硬化為主，而我國是以乙型肝炎引發(fā)的肝硬化為主，肝硬化患者的HBsAg陽性率高達(dá)76.7%[1]，其形成機(jī)制主要是由于肝炎病毒感染導(dǎo)致廣泛性肝細(xì)胞變性壞死、肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、肝臟彌漫性纖維化、結(jié)節(jié)性再生同時伴有假小葉形成，肝臟逐漸變形、變硬而發(fā)展為肝硬化。常選用保肝、降酶、退黃等基礎(chǔ)治療，而終末期肝硬化臨床治療效果差，缺乏廣泛可行的治療手段。干細(xì)胞移植的出現(xiàn), 以其獨(dú)特的生物學(xué)特性，為肝病治療帶來新的治療思路。

臍帶血中造血干細(xì)胞含量豐富，其增殖能力是成人骨髓造血干細(xì)胞的數(shù)倍[2]，近年來國內(nèi)外多項(xiàng)研究證實(shí)人臍帶血單個核細(xì)胞(human umbilical cord blood mononuclear cells, hUCB-MNCs)移植對肝硬化也有顯著的輔助治療效果[3]。

過去認(rèn)為，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)治療肝臟疾病趨向于受損的肝臟區(qū)域而后分化成肝細(xì)胞、修復(fù)受損肝細(xì)胞或通過免疫調(diào)節(jié)抑制炎性反應(yīng)，促進(jìn)肝功能恢復(fù)，但采集大量的骨髓多數(shù)患者很難接受，從而限制了臨床的廣泛應(yīng)用。而人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord msenchymal stem cells, hUC-MSCs)，取材方便，較BMSCs有更高的增殖、分化潛能和免疫調(diào)節(jié)功能，其免疫原性遠(yuǎn)低于BMSCs[4]，具有更加廣泛的臨床應(yīng)用與研究價值[5]。為了提高肝硬化療效，本研究采用了hUCB-MNCs聯(lián)合hUC-MSCs治療肝硬化，筆者前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，hUCB-MNCs具有極其良好的提高患者免疫的功效[6]，因此先行輸注hUCB-MNCs，改善患者整體狀況，提高其免疫功能。而后輸入hUC-MSCs，使其歸巢到肝臟，分化為肝細(xì)胞或進(jìn)入肝臟后修復(fù)受損的肝細(xì)胞[7-9]，并可通過某些細(xì)胞因子的改變, 來調(diào)節(jié)免疫、減輕炎癥反應(yīng)、抗肝細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管增生、抗肝纖維化等修復(fù)損傷肝組織，同時促進(jìn)hUC-MSCs的多向分化[10-12]。兩種細(xì)胞聯(lián)合治療，以更好的發(fā)揮其療效。本研究為單中心、回顧性、非隨機(jī)、自體對照臨床研究。通過觀察聯(lián)合輸注治療肝硬化后各項(xiàng)指標(biāo)的改變，對其治療肝硬化的免疫調(diào)節(jié)及安全性進(jìn)行評價，為肝硬化的治療探索新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 臍帶血全部來源于山東省齊魯干細(xì)胞庫；臍帶采集于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，選取經(jīng)剖宮產(chǎn)足月健康胎兒的臍帶，并征得父母授權(quán)同意，4 ℃預(yù)冷生理鹽水密閉容器保存。MSCs所用無血清培養(yǎng)基購自Invitrogen, USA、流式細(xì)胞分析儀所用單克隆抗體購自美國BD公司；ELISA試劑盒購自上海潤裕生物公司。

1.2 方法

1.2.1 研究對象 選取2016年11月—2019年6月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的失代償性肝硬化患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷符合2000年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會修訂的《病毒性肝炎防治方案》[13]、2005 年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》的肝硬化臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]，診斷為乙型肝炎肝硬化，且Child-Pugh分級為B、C級(失代償期肝硬化)；(2)年齡40～60歲；(3)在加入本研究之前，理解并簽署知情同意書，并且遵守研究方案的要求；同意不參加其他任何臨床研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)除肝衰竭或肝硬化失代償以外的任何嚴(yán)重的全身性疾病，研究者認(rèn)為可能會干擾受試者的治療或干擾受試者的依從性，包括任何未被控制的具有臨床意義的泌尿、循環(huán)、呼吸、神經(jīng)、精神、消化、內(nèi)分泌、免疫等系統(tǒng)疾病及腫瘤等；(2)肝靜脈或門靜脈血栓形成；(3)HIV抗體陽性者；(4)篩選前3個月內(nèi)接受過其他藥物的臨床研究；(5)1年內(nèi)有酗酒或有靜脈藥癮者；(6)HBV DNA>200 IU/ml；(7)腎衰竭，血肌酐>451 mol/L；(8)肺功能指標(biāo)，F(xiàn)EV1<35%，DLCO-SB<39%；(9)根據(jù)AHA 1994年心功能標(biāo)準(zhǔn)D級；(10)其他可能妨礙臨床研究的嚴(yán)重情況。最終納入肝硬化患者11例，根據(jù)患者整體狀況進(jìn)行Child-Pugh分級[15](表1)。入組的肝硬化患者經(jīng)常規(guī)治療(保肝、降黃疸、降血氨、抗病毒、抗感染、必要時輸白蛋白等對癥支持處理，同時靜脈注射促肝細(xì)胞生長素80 mg/d)，治療4周后效果不佳(即肝功能、血氨、凝血因子、血清細(xì)胞因子濃度及淋巴細(xì)胞亞群的無變化，且神經(jīng)、精神癥狀未改善者)，患者自愿申請參加本研究。

表1 入組患者的信息和條件

1.2.2 hUCB-MNCs制備 采集患者外周血，送山東省齊魯干細(xì)胞庫進(jìn)行HLA血清和基因分型，選擇至少4個位點(diǎn)相合的臍帶血作為供者，然后將從臍帶血分離獲取的hUCB-MNCs(山東省齊魯干細(xì)胞庫操作制備)懸浮于含有2%人血白蛋白的0.9%生理鹽水(150 ml)備用。

1.2.3 hUC-MSCs制備 臍帶標(biāo)本采集后至于4 ℃預(yù)冷生理鹽水密閉容器中，6 h內(nèi)完成分離臍帶中華通氏膠，用MSCs無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)制備hUC-MSCs，連續(xù)傳代培養(yǎng)，取P3代hUC-MSCs，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記CD34、CD44 、CD90、CD105和HLA-DR的表達(dá)情況。臺盼藍(lán)染色活性檢測>95%，細(xì)胞HIV、EB病

毒、HBV、HCV核酸分別用PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測，檢測無任何微生物污染。最后制備的hUC-MSCs,用含有2%人血白蛋白的0.9%生理鹽水(150 ml)來懸細(xì)胞備用。

1.2.4 hUCB-MNCs和hUC-MSCs輸注方案 患者經(jīng)常規(guī)治療后，臨床檢測肝腎功能、生化指標(biāo)、腫瘤標(biāo)志物、臨床評估心肺功能、神經(jīng)、精神狀況達(dá)到入組標(biāo)準(zhǔn)。本研究方案為：第1周輸注1次hUCB-MNCs(>18×109/次)，第2、3、4周每周1次，每次輸入hUC-MSCs 1×106/kg，每個患者3次輸注的hUC-MSCs為同一來源的臍帶所分離培養(yǎng)。為了防止可能發(fā)生的過敏反應(yīng)，輸注前5 min靜脈輸入5 mg地塞米松。hUCB-MNCs和hUC-MSCs回輸結(jié)束第4、8、12周后跟蹤隨訪。

1.2.5 hUCB-MNCs和hUC-MSCs輸注的不良反應(yīng)、實(shí)驗(yàn)室檢查及療效評估 一個治療方案結(jié)束后，有1例患者(No.5)腋下體溫38.1 ℃，持續(xù)時間為2 h，患者自行服用布洛芬，大量飲用溫開水發(fā)汗，排尿后體溫降到正常。在之后的隨訪過程中，所有患者均未出現(xiàn)明顯副作用；hUCB-MNCs和hUC-MSCs回輸結(jié)束第4、8、12周后采集靜脈血，檢測肝功能、血氨、凝血功能等各項(xiàng)指標(biāo)，比較輸注前后及輸注不同時間后指標(biāo)變化；同時對比觀察治療前后患者神經(jīng)、精神狀況，根據(jù)患者整體狀況進(jìn)行Child-Pugh肝功能分級。

1.2.6 細(xì)胞輸注后免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子定量檢測 患者在細(xì)胞治療療程結(jié)束4周后開始檢測淋巴細(xì)胞亞群和血清細(xì)胞因子。流式細(xì)胞儀測定CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)、CD19+B淋巴細(xì)胞百分率；ELISA試劑盒量檢測血清IL-6、TNF、IL-10、TGFβ。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究獲得內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批號：2017醫(yī)第(028)號。所納入患者均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs的鑒定 實(shí)驗(yàn)室制備的hUC-MSCs呈貼壁生長，外形為均勻梭形(圖1)，流式細(xì)胞分析檢測，CD44、CD90和CD105表達(dá)均>98%(陽性)(圖2b、2c)，而CD34和HLA-DR表達(dá)為陰性(圖2d)；山東省齊魯干細(xì)胞庫提供的hUCB-MNCs總數(shù)>1.8×109；臺盼藍(lán)染色顯示活性>95%；血清學(xué)和基因HLA分型，供體與受體至少有4個位點(diǎn)相合(山東省齊魯干細(xì)胞庫提供)，無任何可檢測到的微生物污染，對山東臍血庫提供的細(xì)胞再次進(jìn)行了流式細(xì)胞分析，檢測顯示其中CD34+細(xì)胞>1.5%(圖2e)；制備的hUC-MSCs可以被誘導(dǎo)成肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞(圖3)；常規(guī)和核酸PCR/RT-PCR檢測無任何微生物污染；裸鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)無致瘤性； hUC-MSCs活性>95%。

2.2 hUCB-MNCs聯(lián)合hUC-MSCs輸注前后及不同時間對肝功能、血氨及其他狀況的影響 在hUCB-MNCs聯(lián)合hUC-MSCs輸注結(jié)束后，對PT和PTA影響最快，細(xì)胞輸注結(jié)束后第4周即可顯著改善(P值均<0.05)，而患者的肝功能酶學(xué)指標(biāo)在細(xì)胞輸注后第8周逐漸恢復(fù)到正常水平(P值均<0.05)，在輸注結(jié)束第12周時，肝功能指標(biāo)較之前明顯好轉(zhuǎn)(P值均<0.01)(表2)。

表2 細(xì)胞輸注前后肝功能變化

細(xì)胞輸注4周后，患者血清中血氨濃度明顯降低(P<0.05)，隨著時間的延長，血氨水平持續(xù)下降，除患者No. 7、10、11外，其他患者在hUCB-MNCs和HUC-MSCs輸注12周后均降低到正常水平(P值均<0.05)(表3)。

表3 hUCB-MNCs聯(lián)合hUC-MSCs輸注前后血氨值變化

細(xì)胞輸注后第4、8周，5例肝硬化腹水患者的腹水均有所減少，除卻No.10患者仍有少量腹水，且Child-Pugh分級仍然處于C級。10例患者的乏力、食欲、睡眠、精神、腹脹、下肢水腫等明顯改善，血清膽紅素及PT基本恢復(fù)正常，血清Alb也明顯升高，Child-Pugh評分隨之降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(表4)。

表4 hUCB-MNCs聯(lián)合hUC-MSCs輸注前后

注：a，陰性對照組；b，CD44和CD105表達(dá)為98.59%；c，CD44和CD90表達(dá)為99.06%；d，CD34和HLA-DR表達(dá)為0.08%；e，山東臍血庫CD34表達(dá)為1.66%。

注：a，hUC-MSCs分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞；b，hUC-MSCs分化誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞。

2.3 hUCB-MNCs聯(lián)合hUC-MSCs輸注對血清細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞亞群的影響 采集患者靜脈血，ELISA定量檢測hUCB-MNCs和hUC-MSCs輸注前后血清炎性和抗炎細(xì)胞因子的含量，結(jié)果顯示輸注4周后患者血清炎性細(xì)胞因子IL-6、TNFα水平均明顯降低(P值均<0.01)，從8到12周，其血清中含量持續(xù)維持在正常水平；患者血清抗炎細(xì)胞因子IL-10、TGFβ在治療后4周顯著上升(P值均<0.01)，4周后基本恢復(fù)到正常值，到治療后的12周，其表達(dá)水平一直維持在正常值(表5)。

采用流式細(xì)胞儀分析淋巴細(xì)胞亞群比例，細(xì)胞輸注對CD3+T淋巴細(xì)胞無明顯影響，輸注4周后CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞和CD4+CD25+Treg顯著升高(P值均<0.01)；而對CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞具有較明顯的抑制作用，此狀態(tài)一直維持至12周 (表5) 。

表5 hUCB-MNCs聯(lián)合HUC-MSCs輸注前后細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞亞群變化

3 討論

我國HBV感染率高，最終導(dǎo)致肝硬化、肝功能失代償、門靜脈高壓、肝硬化，甚至肝癌等，死亡率呈逐年上升的趨勢。內(nèi)蒙古地區(qū)是少數(shù)民族聚集地，人群感染HBV發(fā)生率更高[16]。加之內(nèi)蒙古地區(qū)冬天比較寒冷和傳統(tǒng)習(xí)慣，多數(shù)男性喜歡飲酒，更加重了肝細(xì)胞的損傷，加速了肝硬化、門靜脈高壓以及肝癌的發(fā)生，因此很多患者在感染肝炎病毒后，發(fā)生肝硬化失代償?shù)哪挲g相對較輕，大多數(shù)在60歲之前，而且以男性居多。

肝功能失代償并發(fā)肝硬化時，多數(shù)患者一般狀況較差，免疫功能低，易并發(fā)感染，特別是腸道感染，再加肝功能失代償年久，多數(shù)患者伴有腹水。所以應(yīng)用干細(xì)胞治療此類患者前需要評估患者整體狀況，本臨床研究參與的患者，Child-Pugh分級多在B級和C級。

由于輸注細(xì)胞需要反復(fù)多次操作，而且肝硬化患者凝血功能差，為了盡量減少對患者的創(chuàng)傷，本研究未采用肝動脈介入注射技術(shù)，而是應(yīng)用多次靜脈回輸?shù)姆椒?，更簡便、安全?/p>

在輸注細(xì)胞前，除了對患者整體狀態(tài)進(jìn)行評估外，還應(yīng)用流式細(xì)胞檢測患者的免疫狀態(tài)。多數(shù)肝硬化患者的免疫功能普遍較低，特別是輔助性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+)，明顯低于正常參考值，因此在hUC-MSCs治療前必須調(diào)整患者一般狀況，提高其免疫功能。筆者團(tuán)隊前期臨床研究[6]發(fā)現(xiàn)，hUCB-MNCs具有良好的提高患者免疫的功效，本研究與患者及其家屬溝通，經(jīng)患者本人及家屬同意，先輸注hUCB-MNCs，以便先改善患者整體狀況，提高其免疫功能。臨床觀察發(fā)現(xiàn)部分患者在輸注hUCB-MNCs后，甚至在1周之內(nèi)，全身不適、食欲、精神狀況明顯改善，流式細(xì)胞分析靜脈血中輔助性T淋巴細(xì)胞有所上升，此效果與筆者團(tuán)隊前期研究[6]結(jié)果相同，說明hUCB-MNCs也可以改善肝硬化患者的一般狀況和免疫功能。

研究提示hUC-MSCs能夠向多方向分化，如神經(jīng)、骨骼、肌肉、心肌、肝細(xì)胞等[17]，同時具有強(qiáng)大的修復(fù)功能[18]。已知肝細(xì)胞感染HBV感染后，肝細(xì)胞損傷、壞死，釋放大量的肝細(xì)胞酶，經(jīng)常規(guī)治療后門靜脈壓降低，腹水形成也相應(yīng)減少，但是胃腸道的有毒物質(zhì)未經(jīng)肝臟處理，直接進(jìn)入體循環(huán)，部分患者血氨明顯升高。而hUC-MSCs輸入后，可以歸巢到肝臟，分化為肝細(xì)胞或進(jìn)入肝臟后修復(fù)受損的肝細(xì)胞，血液內(nèi)的有毒物質(zhì)可以被代謝并排除體外，從而起到治療肝硬化的作用，本研究結(jié)果證實(shí)，hUCB-MNCs和hUC-MSCs聯(lián)合輸入4周后，部分患者的血氨下降，肝硬化癥狀逐步得以控制；除此之外，hUC-MSCs還可以分化為神經(jīng)細(xì)胞，同時具有強(qiáng)大的修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞損傷的功能[19-20]，所以hUC-MSCs輸入后肝硬化患者精神、神經(jīng)狀態(tài)不佳的情況相應(yīng)減輕，筆者推斷可能與此也有一定的關(guān)系，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

由于肝細(xì)胞受損，靜脈血中肝細(xì)胞酶類升高、膽紅素釋放增加、合成Alb功能降低，輸注hUC-MSCs歸巢到肝臟，受微環(huán)境的影響分化為肝細(xì)胞，同時發(fā)揮hUC-MSCs的修復(fù)功能，使損傷的肝細(xì)胞得以恢復(fù)，酶釋放減少，凝血酶原和Alb合成增加，腹水減輕，患者的一般臨床癥狀改善, Child-Pugh評分隨之降低,而Child-Pugh評分又可預(yù)測失代償期肝硬化患者的短期預(yù)后，對選擇適當(dāng)?shù)呐R床治療方案有一定指導(dǎo)作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞治療對于門靜脈高壓導(dǎo)致的腹水療效較差，如本研究的No.10患者腹水減輕并不明顯。

眾所周知，HBV感染后，肝細(xì)胞及其周圍組織同時發(fā)生持續(xù)和反復(fù)慢性炎癥反應(yīng)，由于參與炎性反應(yīng)的細(xì)胞主要是CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞和產(chǎn)生抗體的CD19+B淋巴細(xì)胞，此類細(xì)胞在肝內(nèi)的聚集，釋放大量的炎性細(xì)胞因子，刺激肝內(nèi)纖維細(xì)胞過度增生，導(dǎo)致肝硬化，同時釋放的炎性細(xì)胞因子和抗體也可以進(jìn)一步殺傷和破壞肝細(xì)胞。已知hUC-MSCs本身及其釋放的外泌體具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能[22-23]，可以抑制過度活躍、聚集于肝內(nèi)的炎性細(xì)胞。本研究中心經(jīng)長期的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hUC-MSCs輸注后，隨著時間的延長，炎性細(xì)胞及其炎性因子，如IL-6、TNFα逐漸降低[24]。而CD4+CD25+Treg逐漸上升，說明輸注hUC-MSCs可上調(diào)肝硬化患者CD4+CD25+Treg水平，這一結(jié)果與文獻(xiàn)研究結(jié)果[25-26]相吻合；抗炎細(xì)胞因子IL-10、TGFβ逐漸上升，抑制了炎性反應(yīng)的進(jìn)一步加重，防止肝細(xì)胞持續(xù)損傷、壞死，同時間接地調(diào)控肝組織的進(jìn)一步纖維化[24]。

提示hUCB-MNCs聯(lián)合hUC-MSCs治療可通過影響機(jī)體的免疫狀況來調(diào)節(jié)免疫性疾病的轉(zhuǎn)歸，可能產(chǎn)生的副作用目前還在隨訪觀察中。截至目前，11例入組治療患者均未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。這些研究結(jié)果為hUCB-MNCs和hUC-MSCs聯(lián)合療法可以優(yōu)化肝功能且抑制病情發(fā)展提供了有力的依據(jù)。

hUCB-MNCs和 hUC-MSCs聯(lián)合輸注可以分化為肝細(xì)胞或進(jìn)入肝臟后修復(fù)受損的肝細(xì)胞，抑制炎性因子釋放，上調(diào)Treg水平，從而調(diào)節(jié)肝硬化患者免疫功能，改善患者一般狀態(tài)。針對檢測指標(biāo)的改變，對其治療肝硬化的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行評價，為終末期肝病的治療探索新方法。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：韓霞負(fù)責(zé)申報課題，資料分析，撰寫論文；云升負(fù)責(zé)課題設(shè)計，擬定寫作思路，修改文章并最后定稿。