謝譚芳 朱小勇 黃天衍

中圖分類號 R285.5;R943 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）13-1589-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.13.09

摘 要 目的：研究殼聚糖氧化石墨烯載體（CS-GO）負載冬凌草甲素（CS-GO-oridonin）對人肺癌細胞A549增殖及凋亡的影響。方法：以A549細胞為對象，采用CCK-8法檢測經不同質量濃度的CS-GO（3、6、12、24、48 μg/mL）和負載了等質量冬凌草甲素的CS-GO-oridonin（3、6、12、24、48 μg/mL，以冬凌草甲素質量計，下同）作用后的細胞存活率，并計算CS-GO-oridonin的半數(shù)抑制濃度（IC50）;采用顯微鏡觀察CS-GO和CS-GO-oridonin（均為32 μg/mL）作用2、4、10、24 h后的細胞形態(tài)，并采用熒光標記法觀察細胞對CS-GO、冬凌草甲素、CS-GO-oridonin（均為32 μg/mL）的攝取情況;采用流式細胞術觀察不同質量濃度CS-GO（16、32、64 μg/mL）和CS-GO-oridonin（16、32、64 μg/mL）作用后細胞的凋亡情況及細胞中活性氧（ROS）的含量，采用Western blot法檢測細胞中抗凋亡相關蛋白[髓樣細胞白血病1（Mcl-1）、Bax、Bak]蛋白的表達情況。結果：經不同質量濃度CS-GO作用后，細胞的存活率仍不低于90%;經不同質量濃度CS-GO-oridonin作用后，細胞存活率呈下降趨勢，且顯著低于相同質量濃度的CS-GO組（P<0.01）;CS-GO-oridonin的IC50為32.61 μg/mL。經CS-GO作用后，細胞形態(tài)未見明顯改變;經CS-GO-oridonin作用后，細胞出現(xiàn)皺縮、成團脫落、懸浮物增多等現(xiàn)象;當細胞攝取冬凌草甲素和CS-GO-oridonin后，其熒光均較攝取CS-GO的細胞有所增強。與空白組比較，CS-GO 16、32、64 μg/mL組細胞的凋亡率和細胞中ROS含量、凋亡相關蛋白的表達水平均無顯著變化（P>0.05）;而CS-GO-oridonin 16、32、64 μg/mL組細胞的凋亡率、細胞中ROS含量和Bax、Bak蛋白的表達水平均顯著升高，Mcl-1蛋白的表達水平均顯著降低，且上述指標水平均顯著高于或低于同質量濃度CS-GO組（P<0.05）。結論：CS-GO不會影響A549細胞的增殖及凋亡;CS-GO- oridonin對細胞有明顯的抑制和促凋亡作用，這種作用可能與增加細胞中ROS的產生、調控凋亡相關蛋白的表達有關。

關鍵詞 殼聚糖氧化石墨烯載體;冬凌草甲素;A549細胞;增殖;凋亡

Effects of Oridonin-loaded Chitosan Graphene Oxide on the Proliferation and Apoptosis of A549 Cells

XIE Tanfang，ZHU Xiaoyong，HUANG Tianyan（School of Pharmacy， Guangxi University of TCM/Key Laboratory of Common Technology of Traditional Chinese Medicine Preparation in Universities of Guangxi/Modern Chinese Medicine Preparation Engineering Technology Research Center， Nanning 530022， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of chitosan graphene oxide carrier （CS-GO） loaded with oridonin （CS-GO- oridonin） on the proliferation and apoptosis of human lung cancer A549 cells. METHODS： Taking A549 cells as objects， the survival rate of cells were detected by CCK-8 method after treated with different concentrations of CS-GO（3， 6， 12， 24， 48? ? ? ? ?μg/mL） and CS-GO-oridonin loaded with same mass of oridonin （3， 6， 12， 24， 48 μg/mL， by the weight of oridonin， the same below）. IC50 of CS-GO-oridonin was calculated. The cell morphology were observed by microscope after treated with CS-GO and CS-GO-oridonin （both 32 μg/mL） for 2， 4， 10， 24 h. The uptake of CS-GO， oridonin， CS-GO-orionin （all 32 μg/mL） by cells was observed with fluorescence labeling method. The apoptosis of cells and the content of ROS were observed by flow cytometry after treated with different concentrations of CS-GO （16， 32， 64 μg/mL） and CS-GO-oridonin（16， 32， 64 μg/mL）. The expression of anti-apoptosis related proteins （Mcl-1， Bax and Bak） were detected by Western blot. RESULTS： After treated with different concentrations of CS-GO， the survival rate of cells was still above 90%; after treated with different concentrations of CS-GO-oridonin， the survival rate of cells showed a downward trend， and was significantly lower than that of CS-GO group （P<0.01）; IC50 of CS-GO-oridonin was 32.61 μg/mL. After CS-GO treatment， the cell morphology did not change significantly; after CS-GO-oridonin treatment， the cells shrunk and fell off in clusters， and the suspended matter increased; the fluorescence of oridonin and CS-GO-orionin taken up by cells was enhanced than CS-GO. Compared with blank group， there was no significant change in the apoptosis rate， the content of ROS and the expression of apoptosis-related protein in 16， 32， 64 μg/mL CS-GO groups （P>0.05）; apoptosis rate， the content of ROS， the protein expression of Bax and Bak in 16， 32， 64 μg/mL CS- GO-oridonin groups were increased significantly， while the protein expression of Mcl-1 were decreased significantly. Above indexes were significantly higher or lower than the same concentration CS-GO group （P<0.05）. CONCLUSIONS： CS-GO dose not affect the proliferation and apoptosis of A549 cells; CS-GO-oridonin has obvious inhibition and apoptosis promoting effect on cells， which may be related to increasing ROS production and regulating the expression of apoptosis related proteins.

KEYWORDS? ?Chitosan graphene oxide carrier; Oridonin; A549 cells; Proliferation; Apoptosis

肺癌是全世界最常見的腫瘤之一，是多因素、多基因共同作用所導致的惡性腫瘤[1-2]。目前，對于肺癌患者的臨床治療，西醫(yī)一般采用手術切除、放療、化療等方法。而對于大部分不適合手術切除的實體腫瘤患者，化療常被作為其首選治療方法，但化療的毒副作用較大，導致患者常會出現(xiàn)惡心嘔吐等毒副反應、生存質量明顯下降[3-4]。中醫(yī)藥在治療慢性疾病和疑難雜癥方面有獨特優(yōu)勢，且毒副作用較少;同時，中藥聯(lián)合化療可有效改善患者的生存質量，降低其惡心嘔吐的發(fā)生率，療效好且安全可靠[5-6]。由此可見，中西醫(yī)結合可在肺癌治療領域中發(fā)揮重要作用，已成為目前學者關注的熱點之一[5]。

冬凌草甲素（oridonin）是從唇形科植物碎米椏Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara中分離得到的一種貝殼杉烷類二萜化合物，具有較強的抗腫瘤活性，對多種腫瘤細胞均有顯著的抑制或殺傷作用[7-8]。但由于該化合物水溶性差、生物利用度低等原因，使得其臨床應用受到一定的限制[9]。因此，若能克服上述不足，則將有助于該化合物在抗腫瘤領域的進一步應用。有研究表明，適宜的藥物載體可明顯提高冬凌草甲素的生物利用度[10]。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是石墨烯經氧化超聲處理后所得的產物，其結構表面和邊緣都存在含氧官能團，其中的氧原子易與水形成氫鍵，能很好地分散于水中，從而增加藥物的親水性;同時，GO表面積大、載藥量高、表面含氧官能團豐富且結構易于修飾，是一種很好的藥物載體[11]。殼聚糖（chitosan，CS）的結構中有許多氨基和羥基，具有生物相容性和生物降解性好、無毒性等獨特優(yōu)勢[12]。CS修飾GO得到的CS-GO載體具有良好的水溶性和生物相容性，可用于負載抗腫瘤藥物[13]?；诖?，本研究利用CS-GO作為載體負載冬凌草甲素（即CS-GO-oridonin），初步考察其對人肺癌細胞A549增殖、凋亡的影響以及可能機制，為該化合物新型抗腫瘤制劑的研發(fā)提供理論和技術支持，為肺癌的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括SQP JP-04型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]、HWCL-3型磁力攪拌器（鄭州長城科工貿有限公司）、TGL-16M型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）、Epsilon 2-4型冷凍干燥機（德國LSC Christ公司）、KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、SW-CJ-1D型超凈工作臺（蘇州智凈凈化設備有限公司）、BSC-1300ⅡB2型生物安全柜[西班泰克凈化設備（蘇州）有限公司]、311型CO2恒溫培養(yǎng)箱和F3型移液器（美國Thermo Fisher Scientific公司）、DMIL LED型倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）、AMR-100型酶標儀（杭州奧盛儀器有限公司）、NovoCyte型流式細胞儀（美國Agilent公司）、Tanon-5200型全自動化學發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

冬凌草甲素對照品（批號MUST-19011510，純度99.64%）購自成都曼思特生物科技有限公司;GO（厚度0.8～1.2 nm，單層）購自南京先豐納米材料科技有限公司;CS（乙酰度87.2%，分子量161.1 Da）購自南通興成生物制品廠;透析袋（截留分子量14 000 Da）購自北京白鯊易科技有限公司;F12K培養(yǎng)基、胎牛血清（批號分別為21127-022、10270-106）均購自美國Gibco公司;磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）、0.25%胰蛋白酶、CCK-8試劑、流式細胞儀專用binding buffer、兔髓樣細胞白血病1（Mcl-1）多克隆抗體、兔Bax多克隆抗體、兔Bak多克隆抗體、兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號分別為C1741、C1812、C1706、CY1698、202009、202008、202009、202009、202008）均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒（批號556547）購自美國BD公司;FITC試劑（貨號46950）購自美國Sigma公司;2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）、活性氧（ROS）檢測試劑盒（貨號均為S0033）均購自碧云天生物技術有限公司;蛋白質Marker（批號P12103）購自美國Helix公司;抗熒光萃滅封片劑[含4′，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）]、十二烷基硫酸鈉（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號分別為S2110、S8010、T8090、PC0020）均購自北京索萊寶科技有限公司;聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、電化學發(fā)光（ECL）試劑（批號分別為IPVH00010、1930802）均購自美國Millipore公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細胞

人肺癌細胞A549來源于中國科學院上海細胞庫/干細胞庫。

2 方法

2.1 CS-GO、CS-GO-oridonin的制備

稱取GO適量，加水超聲使分散均勻并定容，制得GO質量濃度為2 mg/mL的分散液。取CS適量，加入2%醋酸溶液，于室溫下攪拌6 h至完全溶解并定容，制得CS質量濃度為2 mg/mL的溶液。將上述GO分散液和CS溶液等體積混合，于室溫下攪拌72 h后，以13 700×g離心30 min;取沉淀，用大量2%醋酸溶液洗滌（以除去未反應完全的CS）后，于4 ℃下以水透析72 h（白天每3 h換水1次，晚上每9 h換水1次），冷凍干燥后即得CS-GO[14]。稱取冬凌草甲素對照品適量，用乙醇溶解后，與用水分散的CS-GO按質量比1 ∶ 1混合并在室溫下攪拌24 h，即得CS-GO-oridonin（每克產物含冬凌草甲素0.428 g）。

2.2 細胞培養(yǎng)

將A549細胞接種于含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），待細胞生長至融合時，以0.25%胰蛋白酶消化，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期時進行后續(xù)實驗。

2.3 CS-GO-oridonin對A549細胞抑制作用的考察

采用CCK-8法進行檢測。收集“2.2”項下對數(shù)期細胞，以完全培養(yǎng)基重懸制成細胞懸液，按5×103 mL-1接種于96孔板中，每孔180 ?L，培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，將其隨機分為空白組、CS-GO不同質量濃度組（3、6、12、24、48 μg/mL，以CS-GO的整體質量計，下同）、CS-GO-oridonin不同質量濃度組（3、6、12、24、48 μg/mL，以冬凌草甲素計[10]，下同），每組設6個復孔。空白組加入含2%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基180 μL，其余各組加入含相應質量濃度CS-GO空白載體或CS-GO-oridonin，再加入2%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基180 μL;同時，設置僅含完全培養(yǎng)基的凋零孔。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;使用酶標儀于450 nm波長處測量各孔的光密度（OD）值，計算細胞存活率[細胞存活率=（檢測組細胞OD值-調零孔細胞OD值）/（空白組細胞OD值-調零孔細胞OD值）×100%]，并通過SPSS 22.0軟件計算CS-GO-oridonin的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.4 CS-GO-oridonin對A549細胞形態(tài)的影響觀察

收集“2.2”項下對數(shù)期細胞，以完全培養(yǎng)基重懸制成細胞懸液，按5×103 mL-1接種于96孔板中，每孔180 ?L，培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，分別加入含相應質量濃度CS-GO空白載體或CS-GO-oridonin（32 ?g/mL，質量濃度按“2.3”項下所得IC50設置），再加入2%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基180 μL，分別培養(yǎng)2、4、10、24 h。于上述時間點取細胞適量，用PBS洗滌3次，置于倒置熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)并拍照。

2.5 CS-GO-oridonin被A549細胞攝取情況觀察

取適量CS-GO、冬凌草甲素、CS-GO-oridonin分散在PBS中，加入適量FITC試劑，在避光條件下磁力攪拌12 h。將上述溶液以13 700×g離心30 min，收集離心管中的下層沉淀，并用PBS多次洗滌，直至上清液中不含游離FITC，即得FITC熒光標記的CS-GO、冬凌草甲素、CS-GO-oridonin。取“2.2”項下對數(shù)期細胞，以完全培養(yǎng)基重懸制成細胞懸液，按5×103 mL-1接種于96孔板中，每孔180 ?L，培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，分別加入含相應質量濃度且經FITC標記的CS-GO空白載體或冬凌草甲素或CS-GO-oridonin（質量濃度同“2.4”項），再加入2%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基180 μL，于37 ℃孵育4 h;用PBS沖洗3次，置于4%多聚甲醛溶液中室溫固定30 min;用PBS沖洗3次，棄去PBS后，加入抗熒光淬滅封片液（含DAPI）50 μL，反應15 min后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察其攝取情況并拍照。

2.6 CS-GO-oridonin對A549細胞凋亡的影響考察

采用Annexin V-FITC/PI雙染法以流式細胞儀進行檢測。取“2.2”項下對數(shù)期細胞，以完全培養(yǎng)基重懸制成細胞懸液，按5×103 mL-1接種于96孔板中，每孔180 μL，培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，將其隨機分為空白組、CS-GO不同質量濃度組（16、32、64 μg/mL）、CS-GO-oridonin不同質量濃度組（16、32、64 μg/mL，以冬凌草甲素計，質量濃度按“2.3”項下所得IC50的1/2、1、2倍設置）?？瞻捉M加入含2%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基2 mL，其余各組加入含相應質量濃度CS-GO空白載體或CS-GO- oridonin，再加入2%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h;棄去培養(yǎng)基，以PBS清洗后，用0.25%胰蛋白酶消化，吸除多余的胰蛋白酶消化液;加入完全培養(yǎng)基輕輕吹打并收集細胞，以1 000×g離心5 min，棄去上清液，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。取5萬～10萬個重懸的細胞，于4 ℃下以1 000×g離心5 min，棄去上清液;加入預冷PBS 1 mL，輕輕振蕩使細胞懸浮，于4 ℃下以1 000×g離心5 min，棄去上清液，再次重復此過程2次。將上述處理后的細胞重懸于binding buffer 200 μL中，依次加入Annexin V-FITC試劑和PI試劑各10 μL，輕輕混勻，于4 ℃下避光孵育30 min;再加入binding buffer 300 μL，用流式細胞儀檢測細胞總凋亡率（細胞總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率）。

2.7 CS-GO-oridonin對A549細胞中ROS含量的影響考察

收集“2.2”項下對數(shù)期細胞，按“2.6”項下方法分組（每組設3個復孔）、給藥。細胞培養(yǎng)5 h后，將其重懸于DCFH-DA溶液（用無血清的F12K培養(yǎng)基稀釋至DCFH-DA終濃度為10 μmol/L）1 mL中，調整細胞密度為1×106 mL-1，于37 ℃下孵育20 min（每隔3 min顛倒混勻1次），使DCFH-DA探針和細胞充分接觸。孵育結束后，用無血清F12K培養(yǎng)基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的游離DCFH-DA。收集各組細胞，用PBS 500 μL重懸，調整細胞密度為1×106 mL-1，使用流式細胞儀檢測細胞中ROS的含量。

2.8 CS-GO-oridonin對A549細胞中的Mcl-1、Bax、Bak蛋白表達水平的影響檢測

采用Western blot法進行檢測。收集“2.2”項下對數(shù)期細胞，按“2.6”項下方法分組（每組設3個復孔）、給藥。細胞培養(yǎng)24 h后，提取其蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白置于沸水浴中10 min使變性，取變性蛋白20 μg，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳后，蛋白以濕轉法轉移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;加入Mcl-1、Bax、Bak、GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;用PBST溶液洗滌5 min×3次，加入HRP標記的IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h;用PBST溶液洗滌5 min×3次，以ECL顯色，于全自動化學發(fā)光分析儀上成像。使用Tanon GIS 4.2軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目標蛋白與內參GAPDH條帶的灰度值比值作為目標蛋白的表達水平。

2.9 統(tǒng)計學方法

用Graphpad Prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s或x表示，組間比較采用單因素方差分析。檢驗標準α=0.05，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 CS-GO-oridonin對A549細胞的抑制作用

當培養(yǎng)時間為24 h時，不同質量濃度CS-GO組細胞的存活率均在90%以上;而不同質量濃度CS-GO-oridonin組細胞的存活率均較空白組顯著降低，且顯著低于同質量濃度CS-GO組（P<0.01），且CS-GO-oridonin 48 μg/mL組細胞的存活率僅為（27.12±0.01）%，詳見表1。CS-GO-oridonin的IC50值為32.61 μg/mL。

3.2 CS-GO-oridonin對A549細胞形態(tài)學的影響

以CS-GO培養(yǎng)至24 h時，細胞形態(tài)仍保持正常，且形態(tài)飽滿、均一性好，詳見圖1。以CS-GO-oridonin培養(yǎng)至24 h時，細胞出現(xiàn)了皺縮、不規(guī)則現(xiàn)象，且可見其成團脫落、懸浮狀的現(xiàn)象增多，詳見圖2。

3.3 CS-GO-oridonin被A549細胞攝取的情況

CS-GO、冬凌草甲素和CS-GO-oridonin被A549細胞攝取情況的顯微圖見圖3（圖中，DAPI表示染色后呈藍色熒光的細胞核，F(xiàn)ITC表示被細胞攝取后呈綠色熒光的CS-GO空白載體或冬凌草甲素或CS-GO-oridonin，Merge表示兩者疊加）。由圖3可見，當細胞攝取CS-GO后，其熒光較弱;而當細胞攝取冬凌草甲素、CS-GO-oridonin后，其熒光均有所增強。

3.4 CS-GO-oridonin對A549細胞凋亡的影響

CS-GO-oridonin 16、32、64 μg/mL組細胞的凋亡率均顯著高于空白組（P<0.01），且顯著高于同質量濃度CS-GO組（P<0.01），詳見圖4、表2。

3.5 CS-GO-oridonin對A549細胞中ROS含量的影響

CS-GO-oridonin 16、32、64 μg/mL組細胞中ROS含量均顯著高于空白組（P<0.01），且顯著高于同質量濃度CS-GO組（P<0.01），詳見表2。

3.6 CS-GO-oridonin對A549細胞中Mcl-1、Bax、Bak蛋白表達水平的影響

CS-GO-oridonin 16、32、64 μg/mL組細胞中Mcl-1蛋白的表達水平均顯著低于空白組，且顯著低于同濃度CS-GO組（P<0.01）;Bax、Bak蛋白的表達水平均顯著高于空白組，且顯著高于同質量濃度CS-GO組（P<0.05或P<0.01），詳見圖5、表3。

4 討論

本研究通過CCK-8法檢測不同質量濃度CS-GO- oridonin對A549細胞存活率的影響，發(fā)現(xiàn)其對細胞均有抑制作用，且隨著其質量濃度的提高，細胞存活率有逐漸降低的趨勢;同時，各CS-GO-oridonin組細胞的存活率均顯著低于同質量濃度CS-GO組，表明CS-GO負載等質量冬凌草甲素后可以有效抑制A549細胞的生長。此外，本研究通過CCK-8法得出CS-GO-oridonin的IC50為32.61 μg/mL，故參考該值，以32 μg/mL作為細胞形態(tài)學研究、攝取實驗的CS-GO-oridonin的實驗濃度;同時，以該質量濃度作為細胞凋亡率、細胞中ROS含量及相關蛋白表達水平檢測的中間濃度，再將其1/2、2倍作為低、高濃度（16、64 μg/mL）。

本研究結果顯示，以32 μg/mL的CS-GO空白載體培養(yǎng)A549細胞24 h后，細胞存活率仍在90%以上，且細胞形態(tài)仍保持正常;而載藥后的CS-GO-oridonin（32? ? ? μg/mL）對細胞形態(tài)的影響較大，提示CS-GO負載的oridonin對A549細胞有殺傷作用，使其形態(tài)發(fā)生了變化。細胞攝取情況觀察結果顯示，CS-GO（32 μg/mL）、冬凌草甲素（32 μg/mL）、CS-GO-oridonin（32 μg/mL）均能進入A549細胞的細胞核中，且后兩者的熒光較CS-GO有所增強，提示冬凌草甲素被CS-GO載體負載后，能被細胞攝取并集中于細胞核內;但CS-GO-oridonin被攝取后的熒光強度弱于冬凌草甲素，提示其靶向性有待進一步確認。

細胞死亡的主要機制是通過細胞凋亡實現(xiàn)的，凋亡是指由基因調控的細胞程序性死亡[15]。細胞凋亡失調發(fā)生在各種腫瘤細胞中，這使得腫瘤細胞難以被殺傷，因此激活凋亡途徑或抑制抗凋亡途徑的藥物均具有治療腫瘤的潛力[16]。在本研究中，不同質量濃度CS-GO-oridonin組細胞的凋亡率均顯著高于空白組，且亦顯著高于相同質量濃度CS-GO組，說明CS-GO-oridonin可誘導A549細胞的凋亡。

有研究表明，提高腫瘤細胞中ROS水平可有助于藥物抗腫瘤作用的發(fā)揮，ROS水平的增加又可增強腫瘤細胞對藥物的敏感性，從而調節(jié)細胞內相關通路信號轉導、調控凋亡蛋白表達、誘導細胞周期阻滯、增強細胞內氧化應激、誘導腫瘤細胞凋亡、提高腫瘤細胞對其他化療藥物的敏感性，最終發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。在A549細胞凋亡過程中，相關凋亡蛋白發(fā)揮著重要作用：Bax具有促進凋亡作用，是細胞凋亡通路的重要組成部分[18];Bak可以誘導線粒體碎裂和細胞色素C釋放，刺激Bax的表達[19]。Mcl-1蛋白主要定位于線粒體外膜，其在細胞的分化、誘導凋亡中起著重要的作用，可將Mcl-1作為腫瘤治療的新靶點;其主要作用機制如下：在細胞毒制劑等誘導細胞凋亡的條件下，其可通過螯合促凋亡蛋白Bax/Bak而抑制腫瘤細胞凋亡，還可與增殖細胞核抗原相互作用來調控細胞的分化過程[20-23]。本研究經CS修飾GO得到CS-GO載體，再經CCK-8法證實此載體安全性高;負載冬凌草甲素后，CS-GO-oridonin對A549細胞的增殖有抑制作用，并能誘導細胞凋亡;通過檢測細胞中ROS含量以及Mcl-1、Bax、Bak蛋白表達水平的變化情況推測，CS-GO-oridonin誘導A549細胞凋亡的機制可能是通過促進細胞中ROS的產生，同時通過下調Mcl-1蛋白并上調Bax、Bak蛋白的表達，從而實現(xiàn)對A549細胞的殺傷作用。

綜上所述，CS-GO不會影響A549細胞的增殖及凋亡;CS-GO-oridonin對A549細胞有一定的抑制和促凋亡作用，其機制可能與促進細胞中ROS的產生以及調控相關凋亡蛋白的表達有關。本研究為冬凌草甲素抗腫瘤制劑的開發(fā)提供了參考，為進一步探討CS-GO-oridonin的抗腫瘤作用機制奠定了基礎。后續(xù)本課題組將借助網(wǎng)絡藥理學技術，重點挖掘該制劑誘導A549細胞凋亡的潛在作用機制。

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（收稿日期：2020-12-11 修回日期：2021-05-11）

（編輯：張元媛）