周 敏，石瑩瑩，李樹奇，張凱林，3，崔永亮，張 森，張先燚，孔祥蕾，4

（1.安徽師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院,蕪湖 241000；2.南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院元素有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071；3.天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院,天津 300072；4.南開大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程創(chuàng)新中心,天津 300071）

自頂向下（Top-down）的蛋白質(zhì)組學(xué)能夠在完整蛋白質(zhì)的分子水平上提供精準(zhǔn)和豐富的生物學(xué)信息，在蛋白質(zhì)翻譯后修飾及其關(guān)聯(lián)性等研究中有著獨(dú)特的優(yōu)勢［1～3］.在此類研究中，需要使用不同的裂解方式，如碰撞輔助解離（CAD）或碰撞誘導(dǎo)解離（CID）［4，5］、高能碰撞解離（HCD）［6］、電子捕獲解離（ECD）［7～10］、電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）［11，12］及紅外多光子解離（IRMPD）［13～17］等，對多種多肽和蛋白分子進(jìn)行多樣化的串聯(lián)質(zhì)譜研究和數(shù)據(jù)分析.如果在實(shí)驗(yàn)中采用不同解離方法的組合，如IRMPD+ECD，IRMPD+ETD以及ETD+CID（HCD）等，則能更有效地提高肽鏈的裂解效率，獲得更豐富的結(jié)構(gòu)信息［18～24］.

近年來，紫外光解離（UVPD）技術(shù)因其獨(dú)特和高效的裂解模式，在此類應(yīng)用中受到廣泛關(guān)注［25～34］.盡管對有機(jī)小分子或短肽UVPD的實(shí)驗(yàn)研究在飛行時間質(zhì)譜和線性離子阱等不同的質(zhì)譜儀器上已經(jīng)廣泛開展，但對于完整的蛋白質(zhì)離子來說，其UVPD實(shí)驗(yàn)需要借助于具有很高分辨率的質(zhì)譜儀器.2013年，Shaw等［25］對軌道阱（Orbitrap）質(zhì)譜儀進(jìn)行改裝，通過加裝光學(xué)窗口將紫外激光引入到HCD池中，并利用Orbitrap對光解離的碎片離子進(jìn)行了高分辨的質(zhì)譜分析.2016年，Shaw等［34］對一臺磁場強(qiáng)度為15特斯拉（15 T）的高分辨傅里葉變換離子回旋共振（FT-ICR）質(zhì)譜儀進(jìn)行改裝，并獲得了完整蛋白的193 nm的UVPD質(zhì)譜，并研究了光致電子對這一解離過程的影響.本文將一臺準(zhǔn)分子激光器與一臺7 T的FT-ICR質(zhì)譜儀相結(jié)合，系統(tǒng)地研究了不同電荷態(tài)（+7～+13）的質(zhì)子化泛素蛋白離子在193 nm紫外激光照射下裂解產(chǎn)生的碎片離子質(zhì)譜，并將該分析結(jié)果與在同一裝置上獲得的CAD實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了比較.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

牛泛素蛋白（Bovine ubiquitin，純度98%）購自Sigma-Aldrich公司，未經(jīng)純化直接使用；Milli-Q型超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；甲醇（色譜純）購于百靈威科技；乙酸（色譜純）購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；進(jìn)行電噴霧電離源（ESI）實(shí)驗(yàn)前，以水為溶劑制備2 mmol/L牛泛素蛋白溶液，并進(jìn)一步稀釋成為1μmol/L水/甲醇/乙酸（體積比49∶49∶2）溶液直接使用.

自行構(gòu)建紫外-可見-紅外光解離質(zhì)譜/光譜研究平臺［35，36］，該平臺配有一臺電噴霧離子源的IonSpec型傅里葉變換離子回旋共振（FT-ICR）質(zhì)譜儀（7.0 T，美國Varian公司）和多臺激光器；Excimer Lasers Series CL5300型準(zhǔn)分子激光器（193 nm）購自俄羅斯OPTOSYSTEMS公司；激光照射時間利用一臺程序控制的SSH-R型機(jī)械快門（日本Sigma-Koki株式會社）來實(shí)現(xiàn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)中質(zhì)譜采用正離子模式，質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍為400～2000.ESI離子源預(yù)熱溫度設(shè)定為80℃，探針電壓根據(jù)不同價態(tài)的目標(biāo)離子分別進(jìn)行優(yōu)化后設(shè)定：+7～+10和+11～+13價離子分別設(shè)定為3.6和3.1 kV.

使用注射泵將制備的牛泛素蛋白樣品溶液以120μL/h的速度注入電噴霧離子源中，產(chǎn)生不同價態(tài)的目標(biāo)蛋白離子.通過存儲波逆傅里葉變換的方法［37］，依次在傅里葉變換離子回旋共振儀的分析池中選出不同電荷態(tài)的泛素蛋白離子并進(jìn)行光解離質(zhì)譜研究.

光解離實(shí)驗(yàn)中，將193 nm的紫外激光引入到分析池中照射母體離子，并記錄解離后的質(zhì)譜圖.光路系統(tǒng)經(jīng)過嚴(yán)格的準(zhǔn)直調(diào)節(jié)，避免由于光束照射到分析池表面而影響電子對解離過程.照射時間為8 s，激光器的典型輸出能量為0.5 mJ/pulse，頻率為10 Hz.

在激光照射過程中，為更加有效地收集碎片離子，利用脈沖閥將氮?dú)夥?次引入質(zhì)譜儀的分析池中，使得分析池的真空約維持在8.0×10-6Pa.激光照射結(jié)束后，等待5 s，當(dāng)系統(tǒng)真空恢復(fù)到約1.0×10-7Pa時，開始采集質(zhì)譜數(shù)據(jù).在對比的CAD實(shí)驗(yàn)中，離子的產(chǎn)生和選擇過程相同，但離子的裂解則通過持續(xù)非共振輻射（SORI）［38］的方式來實(shí)現(xiàn).

1.3 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析利用實(shí)驗(yàn)室自編的數(shù)據(jù)分析軟件（NKTD）進(jìn)行［39］.通過“一對多”的方法尋找目標(biāo)碎片離子，并將實(shí)驗(yàn)峰與理論峰進(jìn)行匹配和打分，用于發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)不同價態(tài)和類型的碎片離子.所有主要離子類型（a，a+1，b-1，b，b+1，c-1，c，c+1，x-1，x+1，x+1，y，y-1，z-1，z和z+1）以及H2O和NH3損失可能產(chǎn)生的碎片離子均被考慮［25］.質(zhì)譜峰的誤差容忍和最低信噪比（S/N）被分別設(shè)置為0.002%和S/N＞3，每張質(zhì)譜圖通過累加3次得到.

2 結(jié)果與討論

2.1 光解離質(zhì)譜

將193 nm激光引入FT-ICR質(zhì)譜儀的分析池，并對激光能量和照射時間進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得紫外光解離后產(chǎn)生的碎片離子的質(zhì)譜.但對于泛素離子，所觀察到的碎片離子的豐度和種類仍非常有限.進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在激光照射過程中向分析池中引入適當(dāng)?shù)呐鲎矚怏w氮?dú)猓梢悦黠@改善碎片離子的豐度和種類.但過多地引入氣體，會在一定程度上破壞分析池中的真空，反而會降低觀察到的離子種類，并使儀器的分辨率和測量的質(zhì)量準(zhǔn)確度明顯變差.綜合優(yōu)化上述條件后，獲得了不同電荷態(tài)（+7～+13）的泛素蛋白離子在吸收193 nm紫外光子后產(chǎn)生的光解離碎片離子質(zhì)譜（圖1）.可見，+7和+8價的泛素蛋白離子裂解產(chǎn)生的碎片離子相對較少，且大多分布在母體離子峰附近；而+10和+11價的離子裂解產(chǎn)生的碎片離子相對較多，且質(zhì)荷比（m/z）的分布相對較廣.

Fig.1 193 nm UVPD mass spectra of ubiquitin ions with different charge statesThe corresponding charge states of（A）—（G）were+7—+13.

2.2 數(shù)據(jù)分析及討論

為了對以上數(shù)據(jù)進(jìn)一步深入理解，利用本課題組自行開發(fā)的NKTD軟件對獲得的不同電荷態(tài)（+7～+13）離子的光解離質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，即對其中的碎片離子進(jìn)行指認(rèn)、歸屬和分析（圖2）.為了便于比較，也對+7～+13價的泛素離子進(jìn)行了CAD實(shí)驗(yàn)及相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見圖2.另外，為了更好地說明離子種類的分布情況，CAD和UVPD實(shí)驗(yàn)結(jié)果中不同種類碎片離子的占比分布信息分別列于圖3和圖4.CAD實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的離子種類為b離子和y離子，與文獻(xiàn)［4］報道一致.對于大部分不同價態(tài)的離子，其主要碎片為y離子；對于+9～+11價的離子，其b離子占總碎片離子的比例為40%～50%（圖3）.對于UVPD實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其碎片離子組成基本包含全部種類的碎片離子.其中，最重要的碎片離子為y離子和a離子.盡管b離子和z離子在所有價態(tài)離子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中都能被觀察到，但在不同價態(tài)離子中所占的比例有所不同（圖4）.這表明193 nm UVPD過程中同時存在分子內(nèi)振動再分配前與再分配后發(fā)生的裂解模式，與文獻(xiàn)［25］報道一致.但從細(xì)節(jié)來看，這些結(jié)果與在Orbitrap質(zhì)譜儀進(jìn)行UVPD實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果也有區(qū)別.Brodbelt等［25］發(fā)現(xiàn)，a，x，y和z離子擁有較強(qiáng)的信號，但b離子的信號較弱.本實(shí)驗(yàn)中獲得信號相對較強(qiáng)的b離子，這與向分析池中引入的碰撞氣體所引發(fā)的進(jìn)一步碰撞輔助解離有關(guān).

Fig.2 Fragment ion analysis of ubiquitin ions with different charge states(+7—+13),obtained by the methods of CAD(A—G)and 193 nm UVPD(A′—G′),respectivelyThe corresponding charge states of（A）—（G）were+7—+13.The charge states of the corresponding ions were identified in each subgraph.The abscissa of each subgraph corresponded to the amino acid sequence of ubiquitin，and the ordinate corresponded to the intensity of fragment ion，and the types of fragment ions were represented by their colors.

Fig.3 The types and distribution of CAD fragment ions of ubiquitin ions with different charge states(+7—+13,A—G)The values indicated the ratios of corresponding ions in different types.

Fig.4 The types and distribution of UVPD fragment ions of ubiquitin ions with different charge states(+7—+13,A—G)The values indicated the ratios of corresponding ions in different types.

圖2 和圖5分別給出不同裂解方式獲得的不同價態(tài)蛋白離子序列的斷裂位點(diǎn)及其覆蓋率.其中UVPD實(shí)驗(yàn)與CAD實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯不同：對于不同價態(tài)的離子，其裂解的位點(diǎn)和覆蓋率也有較大區(qū)別.對于+7價離子，其序列覆蓋率明顯優(yōu)于CAD實(shí)驗(yàn)結(jié)果；對于+8和+9價離子，其覆蓋率（約20%）與CAD實(shí)驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)，但2種方法中發(fā)生斷裂的位點(diǎn)則明顯不同，具有較好的互補(bǔ)性.對于+10～+12價離子，UVPD實(shí)驗(yàn)中離子斷裂位點(diǎn)的覆蓋率顯著高于CAD實(shí)驗(yàn)結(jié)果.其中，對于+11價離子，其UVPD碎片覆蓋率接近80%，遠(yuǎn)優(yōu)于CAD實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的20%.這一結(jié)果雖然低于Shaw等［25］在Orbitrap上獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（接近100%），但與Shaw等［34］在15 T的FT-ICR質(zhì)譜儀上獲得的92%的碎片覆蓋率已經(jīng)比較接近.對于+13價離子，UVPD實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然與CAD相比有很大提高，但仍低于20%.注意到UVPD方法與CAD方法在斷裂方式和位點(diǎn)上的互補(bǔ)，將2種實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果進(jìn)行組合，可以方便地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)離子碎片覆蓋率的提高（圖5中CAD+UV圖例）.

Fig.5 Sequence coverage observed during the cleavage of ubiquitin ions with different charge states(+7—+13)by different methods

雖然本文實(shí)驗(yàn)中獲得的+11價離子的覆蓋率已經(jīng)接近Shaw等［25，34］在Orbitrap及FT-ICR質(zhì)譜儀上所獲得的結(jié)果，但仍有一定的區(qū)別.本文實(shí)驗(yàn)中UVPD碎片覆蓋率明顯與離子價態(tài)相關(guān)，但Shaw等［25］在Orbitrap上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果則并未體現(xiàn)出這種相關(guān)性，即不同價態(tài)的離子在HCD池中發(fā)生UVPD后產(chǎn)生的覆蓋率基本相當(dāng).本文實(shí)驗(yàn)中的低價態(tài)離子的覆蓋率明顯低于+10～+12價離子，這一現(xiàn)象更接近于早先在FT-ICR質(zhì)譜儀上進(jìn)行的ECD實(shí)驗(yàn)結(jié)果［7，8］，顯示出蛋白離子的解離程度可能與其空間折疊程度有著某種關(guān)聯(lián).另外，本文實(shí)驗(yàn)中觀察到大部分離子的整體蛋白序列覆蓋率和碎片離子種類與豐度仍比較低.其原因是多面的：（1）UVPD實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的具有較高初始平動能的離子難以被有效囚禁和被探測到，仍需要進(jìn)一步改進(jìn)或優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件；（2）受到本次實(shí)驗(yàn)中儀器本身?xiàng)l件的一些限制，如由于實(shí)驗(yàn)中使用的FT-ICR質(zhì)譜儀的控制系統(tǒng)較為老舊，內(nèi)存有限，對比之前實(shí)驗(yàn)中的單張質(zhì)譜圖一般都采用了50次或以上的積累［25，34］，目前系統(tǒng)無法完成3次以上的數(shù)據(jù)積累；與Shaw等［34］在FT-ICR上的實(shí)驗(yàn)相比，本文實(shí)驗(yàn)中采用的磁場強(qiáng)度為7 T也明顯低于Shaw等的實(shí)驗(yàn)（15 T）；（3）目標(biāo)離子選擇目前都是在FT-ICR分析池中完成的，經(jīng)過離子選擇后，在進(jìn)行UVPD實(shí)驗(yàn)前，+7和+13價離子的強(qiáng)度大約只有+11價離子強(qiáng)度的1/5，無法完成目標(biāo)離子在UVPD前的預(yù)積累，這也可能是本實(shí)驗(yàn)中+7和+13價離子覆蓋率低的一個重要原因.

基于上述分析和討論，為更好地發(fā)揮UVPD技術(shù)與FT-ICR質(zhì)譜在蛋白結(jié)構(gòu)分析中的作用，仍需要從實(shí)驗(yàn)方法和儀器方面加以改進(jìn).除了計劃通過更新儀器控制系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的多次累加和引入線性離子阱以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)離子的選擇和預(yù)富集之外，還計劃在離子活化和碎片離子的冷卻和有效囚禁方面進(jìn)行改善，如通過組合不同裂解方法來改善其碎片離子種類和蛋白序列覆蓋率，以便擴(kuò)展到更大尺寸的蛋白離子的研究中.

3 結(jié) 論

通過將193 nm激光引入FT-ICR質(zhì)譜儀分析池，獲得了蛋白質(zhì)離子紫外光解離（UVPD）質(zhì)譜圖.利用這一方法，對不同價態(tài)的泛素蛋白離子的紫外光解離質(zhì)譜進(jìn)行了系統(tǒng)研究.結(jié)果表明，通過在激光照射過程中向分析池內(nèi)引入碰撞氣體，不僅能增加母體離子的裂解率，還能提高碎片離子的捕獲效率，觀察到較為豐富的不同種類的碎片離子.實(shí)驗(yàn)中獲得了+7～+13價泛素離子的光解離質(zhì)譜，并將其與碰撞輔助解離（CAD）方法產(chǎn)生的碎片譜進(jìn)行了分析比較.結(jié)果表明，相對于CAD中產(chǎn)生的單純的b離子和y離子，UVPD方法能夠產(chǎn)生更為豐富的碎片離子，這些離子一般以a離子和y離子為主.其中，對于+11價離子，蛋白質(zhì)序列的覆蓋率接近80%，但對于+7～+9價及+13價離子，覆蓋率仍較低.通過將UVPD和CAD方法獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行組合，則可以改善其序列覆蓋率，顯示了這兩種方法的互補(bǔ)性.但如何進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)離子解離效率和其序列覆蓋率，以便其能夠在自頂向下蛋白質(zhì)質(zhì)譜學(xué)中發(fā)揮更好的作用，仍需要在離子活化和囚禁，以及數(shù)據(jù)采集和分析等方面進(jìn)行更加深入的研究.