李安然，趙 冰，2，闞 偉，2，宋天舒，孔祥東，卜凡強(qiáng)，孫 立，2，殷廣明，王麗艷，2

（1.齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,2.黑龍江省表面活性劑與工業(yè)助劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,齊齊哈爾 161006）

研究表明，金屬離子在眾多生物過程中扮演著重要的角色［1～3］.金屬離子具有毒性，當(dāng)人體內(nèi)金屬離子的濃度超出正常水平時(shí)，可能會(huì)引起身體異常、紊亂或細(xì)胞死亡，進(jìn)而導(dǎo)致慢性或急性病癥［4～6］.因此，調(diào)節(jié)和監(jiān)控生物體內(nèi)的重金屬離子濃度水平是非常必要的.Cu2+濃度占人體內(nèi)重金屬離子含量的第三位，有助于維持骨骼、血管、免疫功能、神經(jīng)和代謝系統(tǒng)，在鐵的吸收中起著至關(guān)重要的作用［7，8］.Cu2+濃度不足或過量會(huì)導(dǎo)致胃腸功能障礙［9］、威爾遜氏病［10］及肌萎縮性硬化［11］等疾病.此外，Ag+是另一種有毒有害的重金屬離子之一，其毒性也會(huì)對(duì)人體造成重要的傷害.尤其是Ag+與多種代謝物結(jié)合后會(huì)使巰基酶失活，進(jìn)而對(duì)多種細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變作用［12，13］.鑒于Cu2+和Ag+在生物體內(nèi)的重要作用，開發(fā)簡(jiǎn)便、高效及靈敏的方法用于檢測(cè)生物體內(nèi)Cu2+和Ag+濃度的方法具有重要意義.

近年來，原子吸收光譜（AAS）［14］、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP?MS）［15］、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP?AES）［16］、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）［17］和紫外-可見光譜（UV-Vis）［18］等傳統(tǒng)分析方法已用于Cu2+和Ag+濃度的檢測(cè).然而，這些方法存在預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、需要精密儀器和靈敏度較差等缺點(diǎn)，因而在實(shí)時(shí)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中受到限制.熒光光譜法由于具有操作簡(jiǎn)單，選擇性、靈敏度高及適于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛認(rèn)可.基于不同的熒光響應(yīng)機(jī)理，大量文獻(xiàn)分別報(bào)道了具有不同發(fā)射基團(tuán)和不同識(shí)別基團(tuán)的選擇性Cu2+熒光探針和Ag+熒光探針［19～22］.但關(guān)于可區(qū)別性地識(shí)別雙金屬離子的熒光探針的報(bào)道較少［23，24］.

本文以菲并咪唑?yàn)榘l(fā)射團(tuán)，雙Schiff堿為鏈接基團(tuán)，設(shè)計(jì)了一種對(duì)稱型菲并咪唑熒光探針PIP-ph-PIP，合成路線如Scheme 1所示，該探針既可以通過裸眼比色區(qū)別檢測(cè)Cu2+和Ag+，又可以通過熒光光譜選擇性地識(shí)別Cu2+和Ag+.此外，還可以通過ON-OFF-ON的方式實(shí)現(xiàn)的連續(xù)識(shí)別，并實(shí)現(xiàn)了HeLa細(xì)胞中Cu2+和Ag+的定性檢測(cè).

Scheme 1 Synthesis of probe PIP-ph-PIP

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

菲醌（純度99%）、對(duì)硝基苯甲醛（純度98%）、對(duì)苯二甲醛（純度98%）和乙酸銨（純度97%），上海阿拉丁試劑公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、乙酸乙酯、石油醚（60～90℃）和乙醇，天津市天力化工有限公司.參照文獻(xiàn)［25］方法制備4-（1H-菲［9，10-d］咪唑-2-基）苯胺.

LS-55型熒光分光光度計(jì)，美國Perkin Elmer公司；TU-1901型紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis），北京普析通用儀器公司；AVANCE-600型核磁共振波譜儀（1H NMR），德國Bruke公司；X-6型精細(xì)顯微熔點(diǎn)測(cè)試儀，北京泰克儀器有限公司；TEK-ELX800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，美國寶特公司；BrukermicrOTOFQIII型高效液相質(zhì)譜儀（HRMS），德國Bruker Daltonics公司；FV-1000型熒光共聚焦顯微鏡，日本Olympus公司.

1.2 探針PIP-ph-PIP的合成

將0.63 g（2.0 mmol）4-（1H-菲［9，10-d］咪唑-2-基）苯胺、0.13 g（1.0 mmol）間苯二甲醛和20 mL乙醇依次加入50 mL單口燒瓶中，室溫下攪拌6 h；反應(yīng)過程中用薄層色譜（TLC）跟蹤監(jiān)測(cè)，展開劑為乙酸乙酯/石油醚（體積比3∶7），反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)體系中加水，析出固體，經(jīng)過濾、干燥后得到粗產(chǎn)品；粗產(chǎn)品用乙酸乙酯重結(jié)晶，干燥后得到（0.61 g）黃色固體粉末PIP-ph-PIP，產(chǎn)率85%，m.p.＞350℃.IR（KBr），ν?/cm-1：3432，1731，1579，1453，1426，1149，1110，1043，1013，964，923，743，722，615；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：12.53（s，2H，NH），9.21（s，2H，N=CH），8.91（s，H，ArH），8.86（d，J=9.0 Hz，4H，ArH），8.71（d，J=8.0 Hz，4H，ArH），8.52（d，J=9.5 Hz，4H，ArH），8.24（d，J=8.0 Hz，2H，ArH），7.74～7.80（m，1H，ArH），7.72～7.68（m，6H，ArH），7.65（t，J=8.5 Hz，4H，ArH），7.59（d，J=9.0 Hz，2H，ArH）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：178.6，162.3，154.8，139.1，135.6，130.5，129.8，128.3，127.0，126.5，125.8，123.6，122.9，121.5，120.0，119.7；元素分析（C50H32N6理論值）：C 83.91（83.78），H 4.66（4.50），N11.58（11.72）；HRMS（ESI-TOF）for［M+H］+，m/z：716.8488.

1.3 熒光光譜測(cè)定

將探針PIP-ph-PIP用N，N′-二甲基甲酰胺（DMF）配制成濃度為1.0×10-4mol/L的儲(chǔ)備液，測(cè)試用水溶液為Hepes緩沖溶液（10μmol/L，pH=7.4），探針的濃度為1.0×10-5mol/L.測(cè)試用金屬離子為金屬氯鹽或硝酸鹽，測(cè)試用陰離子為陰離子的鈉鹽或鉀鹽.室溫下測(cè)試樣品的熒光光譜，石英比色皿尺寸為1 cm×1 cm×4 cm，激發(fā)波長(zhǎng)為311 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為2.5和5 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 探針PIP-ph-PIP在水相體系中的光譜行為

為了確定主體化合物的識(shí)別體系，通過改變探針PIP-ph-PIP的DMF溶液（1.0×10-5mol/L）中水的體積分?jǐn)?shù)，考察了探針PIP-ph-PIP在不同體積比DMF/H2O（10μmol/L Hepes，pH＝7.4）混合溶劑中紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的變化.圖1（A）給出探針PIP-ph-PIP在不同水的體積分?jǐn)?shù)（fw，%）條件下的紫外光譜.可見，在純DMF溶劑中，探針PIP-ph-PIP只有一個(gè)明顯吸收峰，最大吸收波長(zhǎng)為383 nm，吸光度處于中等強(qiáng)度（?=0.356）.當(dāng)少量水存在時(shí)（fw=10%），探針PIP-ph-PIP的吸收波長(zhǎng)幾乎無變化.當(dāng)fw從20%增加到50%時(shí)，探針的最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移至325 nm，且吸收峰變窄，吸光度增加，最大摩爾吸光系數(shù)（?）達(dá)到0.65，同時(shí)在365 nm處存在一個(gè)小的肩縫.當(dāng)fw＞50%時(shí)，325和365 nm處的2個(gè)吸收峰的強(qiáng)度顯著減小，吸收峰明顯變寬，吸收波長(zhǎng)在400 nm以上表現(xiàn)為一定強(qiáng)度的吸光度.探針PIP-ph-PIP的紫外光譜變化隨水含量變化表現(xiàn)出3種狀態(tài)：水的體積分?jǐn)?shù)較小時(shí)（fw＜10%），探針處于良好的溶解狀態(tài)，其紫外吸收光譜與在純DMF溶劑中的紫外光譜類似；水的體積分?jǐn)?shù)在20%～50%之間時(shí)，不良溶劑（水）體積增加，探針PIP-ph-PIP的溶解度下降，形成部分聚集，導(dǎo)致了紫外光譜中最大吸收光譜的藍(lán)移；當(dāng)水的體積分?jǐn)?shù)＞50%時(shí)，整個(gè)溶劑體系接近于水溶液，探針PIP-ph-PIP的聚集加劇，溶液中探針PIP-ph-PIP顆粒增大，導(dǎo)致了紫外光譜吸收峰變寬，吸光度下降.

Fig.1 Absorption(A)and fluorescent spectra(B)of PIP-ph-PIP with different volume fractions(f w)of water

探針PIP-ph-PIP溶液的熒光發(fā)射光譜隨水的體積分?jǐn)?shù)變化也表現(xiàn)為3種狀態(tài)［圖1（B）］.以311 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，探針PIP-ph-PIP在DMF溶劑中的發(fā)射波長(zhǎng)為461 nm，表現(xiàn)為較弱的熒光發(fā)射，這可能是由于探針在純?nèi)軇┲械淖杂行D(zhuǎn)消耗了激發(fā)態(tài)的能量所致.加入少量水時(shí)，探針溶液的熒光強(qiáng)度開始增大，當(dāng)fw增加到30%時(shí)，探針的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，增強(qiáng)倍數(shù)為純DMF溶液的82倍，表現(xiàn)為強(qiáng)熒光.fw在20%～50%之間時(shí)熒光強(qiáng)度幾乎不變.fw增加到60%時(shí)，探針的熒光強(qiáng)度急劇下降，降為最高強(qiáng)度的1/4，繼續(xù)增加fw，探針溶液保持低熒光發(fā)射狀態(tài).隨著fw的變化，探針PIP-ph-PIP溶液熒光強(qiáng)度由弱熒光變化為強(qiáng)熒光，再變化為中等強(qiáng)度熒光狀態(tài)，這是由于探針分子從溶解態(tài)到部分聚集再到聚集加劇的狀態(tài)變化所致.隨著fw的增加，探針PIP-ph-PIP的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，屬于典型的聚集誘導(dǎo)發(fā)光機(jī)制（AIE）［26］；而大量水存在時(shí)，由于探針PIP-ph-PIP的聚集程度增大引起的熒光猝滅現(xiàn)象屬于典型的聚集誘導(dǎo)猝滅現(xiàn)象（ACQ）［27］.

探針PIP-ph-PIP溶液在紫外燈下的顏色變化及其丁達(dá)爾現(xiàn)象（圖2）更加直觀地證明其在水溶液中的聚集狀態(tài)和熒光變化.由圖2（A）可見，在紫外燈激發(fā)下，隨著fw增加，探針溶液的藍(lán)色熒光先增強(qiáng)后降低，這種現(xiàn)象與探針溶液的熒光光譜變化一致.在暗室中，采用紅色的激光筆照射探針?biāo)芤?，在fw為20%的探針?biāo)芤褐虚_始觀察到紅色光束.這說明探針開始形成聚集，隨著fw增加，紅色光束越來越明顯，說明探針的聚集加劇，丁達(dá)爾現(xiàn)象更明顯［圖2（B）］.上述結(jié)果進(jìn)一步證明，探針在水溶液中逐漸形成聚集，熒光機(jī)制由AIE變?yōu)锳CQ.

Fig.2 Photos of PIP-ph-PIP(10μmol/L)illuminated by UV lamp(A)and red laser pointer(B)in different proportions of DMF/H2O(Hepes 10μmol/L,pH＝7.4)The volume fractions of water from left to right were 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,respectively.

2.2 探針PIP-ph-PIP在水相體系中對(duì)Ag+和Cu2+的選擇性識(shí)別

鑒于探針PIP-ph-PIP的結(jié)構(gòu)特征，在DMF/H2O（體積比1∶99，10μmol/L Hepes，pH=7.4）溶液中，考察了探針PIP-ph-PIP在水相體系中對(duì)金屬離子的識(shí)別情況.分別向淡黃色的探針PIP-ph-PIP水溶液（10μmol/L）中加入K+，Ca2+，Na+，Mg2+，Al3+，Zn2+，F(xiàn)e3+，Pb2+，Ba2+，Hg2+，Ag+，Cr2+，Cd2+，Co2+，Ni2+和Cu2+（100μmol/L）16種金屬離子，靜置5 min后，觀察探針?biāo)芤旱念伾兓?結(jié)果表明，16種金屬離子中，只有Ag+和Cu2+的加入引起了探針PIP-ph-PIP水溶液的裸眼顏色變化（圖S1，見本文支持信息）.在Ag+存在下，探針?biāo)芤河傻S色變?yōu)闇\褐色，并伴有褐色沉淀生成；在Cu2+存在下，探針?biāo)芤河傻S色變?yōu)闇\綠色，并伴有綠色沉淀生成.當(dāng)其它14種金屬離子存在時(shí)，未觀察到探針PIP-ph-PIP水溶液有明顯變化.從探針溶液的顏色和狀態(tài)變化可以初步推斷，探針PIP-ph-PIP在水相體系中能與Ag+和Cu2+發(fā)生作用，并快速形成沉淀.

為了進(jìn)一步明確探針PIP-ph-PIP在水相體系下與Ag+和Cu2+的作用，考察了不同金屬離子加入后探針?biāo)芤簾晒獍l(fā)射光譜的變化情況，結(jié)果如圖3所示.以311 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，探針PIP-ph-PIP水溶液在465 nm處發(fā)射中等強(qiáng)度熒光.加入Ag+和Cu2+后，探針的熒光強(qiáng)度顯著降低，熒光強(qiáng)度分別猝滅為探針單獨(dú)存在時(shí)的1/16和1/12.其它金屬離子存在時(shí)，探針?biāo)芤旱臒晒鈴?qiáng)度只產(chǎn)生了可忽略的微弱變化.熒光發(fā)射光譜的變化表明，探針PIP-ph-PIP對(duì)Ag+和Cu2+產(chǎn)生了熒光識(shí)別作用.從探針溶液裸眼變化情況推斷，探針PIPph-PIP可能分別與Ag+和Cu2+形成配位絡(luò)合物，配位絡(luò)合物沉淀后從水溶液中析出，導(dǎo)致水溶液中探針分子濃度下降，熒光強(qiáng)度顯著降低.此外，探針PIP-ph-PIP中的雜原子與Ag+和Cu2+配位后，在激發(fā)態(tài)下，探針分子與金屬離子（Ag+和Cu2+）之間形成了光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）作用，猝滅了熒光.探針?biāo)芤旱穆阊蹱顟B(tài)變化和熒光光譜的變化說明，探針PIP-ph-PIP對(duì)Ag+和Cu2+具有熒光識(shí)別性能.

Fig.3 Fluorescent emission spectra of PIP-ph-PIP(10μmol/L)in aqueous solution in presence of the various cations(100μmol/L)a.PIP-ph-PIP;b.PIP-ph-PIP+Cu2+;c.PIP-ph-PIP+Ag+.

探針對(duì)金屬離子識(shí)別的選擇性是評(píng)價(jià)探針識(shí)別性能的關(guān)鍵因素.為了驗(yàn)證探針PIP-ph-PIP識(shí)別Ag+和Cu2+的選擇性，測(cè)定了在過量的干擾離子（100μmol/L）存在下，探針PIP-ph-PIP（10μmol/L）識(shí)別Ag+和Cu2+（10μmol/L）的熒光發(fā)射光譜.圖4（A）示出了常見的干擾離子存在時(shí)對(duì)探針識(shí)別Ag+的影響.過量的Cu2+作為干擾離子時(shí)，探針PIP-ph-PIP識(shí)別Cu2+前后的熒光強(qiáng)度變化程度與Ag+單獨(dú)存在時(shí)相當(dāng)（猝滅倍數(shù)16倍），其它干擾離子也沒有影響探針對(duì)Ag+的識(shí)別，表明探針識(shí)別Ag+的熒光強(qiáng)度不受Cu2+及其它離子的干擾.過量的Ag+作為干擾離子時(shí)［圖4（B）］，探針PIP-ph-PIP識(shí)別Cu2+時(shí)熒光強(qiáng)度的猝滅程度比Cu2+單獨(dú)存在時(shí)猝滅程度更強(qiáng)，猝滅程度與Ag+的單獨(dú)存在猝滅程度相當(dāng)（猝滅倍數(shù)仍為16倍），說明過量的Ag+會(huì)干擾探針PIP-ph-PIP對(duì)Cu2+的識(shí)別，而表現(xiàn)為探針PIP-ph-PIP對(duì)Ag+的識(shí)別.上述結(jié)果說明，Cu2+和Ag+同時(shí)存在時(shí)，探針PI-ph-PI可以優(yōu)先識(shí)別Ag+.

Fig.4 Changes of fluorescent intensities of PIP-ph-PIP(10μmol/L)to recognize Ag+(A)and Cu2+(B)(10μmol/L)in presence of the other interference ions(100μmol/L)a.K+,b.Ca2+,c.Na+,d.Mg2+,e.Al3+,f.Zn2+,g.Fe3+,h.Pb2+,i.Ba2+,j.Ag+,k.Hg2+,l.Cr3+,m.Cd2+,n.Co2+,o.Ni2+,p.Cu2+,q.blank.

此外，考察了水相體系pH值變化對(duì)探針PIP-ph-PIP識(shí)別Ag+和Cu2+的影響.由探針PIP-ph-PIP溶液（10μmol/L）在不同pH值（2～12）下識(shí)別Ag+和Cu2+（10μmol/L）前后的熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化情況（圖S2，見本文支持信息）可見，在2種離子存在下，探針PIP-ph-PIP隨pH值改變其熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)分別與探針PIP-ph-PIP單獨(dú)存在時(shí)變化趨勢(shì)類似，說明pH值的變化對(duì)探針PIP-ph-PIP識(shí)別Ag+和Cu2+沒有影響.但探針PIP-ph-PIP的熒光強(qiáng)度受pH變化影響較大.探針在酸性條件下表現(xiàn)為中等強(qiáng)度的熒光，隨著溶液堿性的增加，熒光強(qiáng)度逐漸減弱；當(dāng)溶液的pH≈8.0時(shí)，熒光強(qiáng)度下降到最低；pH值繼續(xù)增大，熒光強(qiáng)度幾乎不再變化.上述結(jié)果說明，熒光探針PIP-ph-PIP在酸性和弱堿性pH范圍內(nèi)對(duì)Ag+和Cu2+識(shí)別表現(xiàn)良好，可用于生物環(huán)境中Ag+和Cu2+的檢測(cè).

在DMF/Hepes（體積比1∶99，pH=7.4）體系中，向探針PIP-ph-PIP溶液（10μmol/L）中逐漸加入Ag+和Cu2+（0～50μmol/L），觀察探針的熒光強(qiáng)度變化情況.由圖5（A）可見，隨著Ag+濃度的增加，探針PIPph-PIP在461 nm處的發(fā)射強(qiáng)度逐漸下降，當(dāng)Ag+濃度達(dá)到20μmol/L時(shí)，熒光發(fā)射強(qiáng)度猝滅到最低值，達(dá)到探針熒光強(qiáng)度的1/25；繼續(xù)增加Ag+濃度，發(fā)射強(qiáng)度幾乎不再變化.由Ag+濃度變化與探針PIP-ph-PIP熒光衰減（I/I0）變化關(guān)系［圖5（A）和（B）］可知，Ag+濃度在0～0.1μmol/L范圍內(nèi)，探針PIP-ph-PIP識(shí)別Ag+表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（R2=0.9978）.根據(jù)公式cDL=3σ/B（cDL為最低檢出限）［28］計(jì)算得到探針檢測(cè)Ag+濃度的檢出限為6.1 nmol/L，該值遠(yuǎn)低于美國環(huán)境保護(hù)局（US EPA）規(guī)定的飲用水中最大水平的Ag+濃度（10 nmol/L）.目前文獻(xiàn)報(bào)道的大多數(shù)熒光探針的Ag+檢出限均高于50 nmol/L［29～31］，檢出限在10 nmol/L左右的熒光探針較少［32］.因此，本文制備的水相體系中具有超低檢出限的Ag+探針PIP-ph-PIP可以用于不同環(huán)境中Ag+濃度的定量檢測(cè).由圖5（C）和（D）可見，在相同的測(cè)試體系下Cu2+濃度達(dá)到10μmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度猝滅為探針單獨(dú)存在時(shí)熒光強(qiáng)度的1/7.Cu2+濃度在0～1μmol/L范圍內(nèi)，探針PIP-ph-PIP識(shí)別Cu2+同樣具有較好的線性關(guān)系（R2=0.9921），檢出限為523 nmol/L.上述結(jié)果說明，探針PIP-ph-PIP識(shí)別Cu2+同樣具有較高的靈敏性，并可用于定量分析待測(cè)樣品的Cu2+濃度.

Fig.5 Fluorescent spectra of PIP-ph-PIP(10μmol/L)with the changes of the concentrations of Ag+(A)and Cu2+(C)(0—50μmol/L)and plots of the linear relation about the recognition of PIP-ph-PIP to Ag+(B)and Cu2+(D)Inset of(A):the fluorescence intensity change of PIP-ph-PIP with the increase of Ag+concentration．Inset of(C):the fluorescence intensity change of PIP-ph-PIP with the increase of Cu2+concentration．

根據(jù)探針PIP-ph-PIP識(shí)別Ag+和Cu2+裸眼觀察狀態(tài)和熒光變化情況，進(jìn)一步通過Job法［33］考察了探針PIP-ph-PIP與Ag+和Cu2+之間的絡(luò)合情況（圖S3，見本文支持信息）.當(dāng)探針PIP-ph-PIP的摩爾分?jǐn)?shù)為0.66時(shí)，熒光強(qiáng)度變化比值（I/I0）均達(dá)到最低.計(jì)算結(jié)果表明，探針PIP-ph-PIP分別與Ag+和Cu2+形成化學(xué)計(jì)量比為1∶2的絡(luò)合物，可分別表示為PIP-ph-PIP—Ag+和PIP-ph-PIP—Cu2+.裸眼觀察到的褐色沉淀和綠色沉淀也說明了這2個(gè)金屬絡(luò)合物的形成.

2.3 絡(luò)合物PIP-ph-PIP—M在水相體系中的連續(xù)識(shí)別

Fig.6 Fluorescent spectra of the in-situ complex of PIP-ph-PIP—Ag+(A)and PIP-ph-PIP—Cu2+(B,10μmol/L)in presence of the different anions(A)a.PIP-ph-PIP;b.PIP-ph-PIP—Ag++SCN-;c.PIP-ph-PIP—Ag++other anions.(B)a.PIP-ph-PIP—Cu2++PO34-;b.PIP-ph-PIP;c.PIP-ph-PIP—Cu2++HPO24-;d.PIP-ph-PIP—Cu2++H2PO4-.

這種ON-OFF-ON連續(xù)識(shí)別效果在自然光和紫外燈照射下裸眼可見.以探針對(duì)Ag+和SCN-的連續(xù)識(shí)別為例，自然光照射下，淺黃色的探針PIP-ph-PIP溶液在Ag+存在時(shí)呈淺褐色，連續(xù)加入SCN-后溶液恢復(fù)到淺黃色［圖7（A）］；在紫外燈照射下，初始的探針溶液表現(xiàn)為亮藍(lán)色（ON），Ag+存在下探針溶液亮度明顯變暗（OFF），藍(lán)色消失，繼續(xù)加入SCN-溶液亮度恢復(fù)（ON），重新呈現(xiàn)藍(lán)色［圖7（B）］.可見，探針的ON-OFF-ON連續(xù)識(shí)別效果既可通過熒光光譜也可通過裸眼觀察實(shí)現(xiàn).為了確定絡(luò)合物識(shí)別SCN-和的定量關(guān)系，通過的濃度滴定，考察了絡(luò)合物PIP-ph-PIP—Ag+和PIP-ph-PIP—Cu2+連續(xù)識(shí)別的線性關(guān)系（圖S4，見本文支持信息）.在1～12μmol/L的濃度范圍內(nèi)，絡(luò)合物PIPph-PIP—Ag+和PIP-ph-PIP—Cu2+熒光強(qiáng)度分別隨濃度的增加得到恢復(fù)，并具有良好的線性關(guān)系，線性偏差分別為R2=0.9957和R2=0.9769，計(jì)算得到絡(luò)合物PIP-ph-PIP—Ag+和PIP-ph-PIP—Cu2+檢測(cè)的檢出限分別為240 nmol/L和169 nmol/L.向探針PIP-ph-PIP溶液中連續(xù)加入Ag+和，ON-OFF-ON連續(xù)識(shí)別效果可重復(fù)5次（圖S5，見本文支持信息）.上述結(jié)果表明，探針對(duì)的ON-OFF-ON連續(xù)識(shí)別既可以通過裸眼觀察實(shí)現(xiàn)定性分析，也可以通過熒光光譜實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè).

Fig.7 Graphs of the subsequent ON-OFF-ON effect of PIP-ph-PIP under the day light(A)and UV lamp(B)(A1,B1)PIP-ph-IP;(A2,B2)PIP-ph-PIP+Ag+;(A3,B3)PIP-ph-PIP+Cu2+.

2.4 細(xì)胞成像

為了證明探針PIP-ph-PIP在生物體內(nèi)對(duì)Ag+和Cu2+的響應(yīng)能力，首先評(píng)價(jià)了探針PIP-ph-PIP對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的毒性.毒性測(cè)試結(jié)果表明，不同濃度（0～50μmol/L）的探針PIP-ph-PIP在HeLa細(xì)胞內(nèi)的成活率均高于85%（圖S6，見本文支持信息），說明探針分子的毒性較低，可用于細(xì)胞檢測(cè)，為探針PIP-ph-PIP在活細(xì)胞中的熒光成像提供了有力的支持.圖8給出探針PIP-ph-PIP在活體HeLa細(xì)胞中的成像結(jié)果.由圖8（B）可見，探針PIP-ph-PIP（10μmol/L）與活體HeLa細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞發(fā)射明顯的藍(lán)色熒光；將細(xì)胞分別用10μmol/L的Ag+和Cu2+處理后再與探針PIP-ph-PIP共同培養(yǎng)時(shí)，藍(lán)色的熒光信號(hào)明顯減弱，當(dāng)Ag+和Cu2+濃度達(dá)到20μmol/L時(shí)，幾乎觀察不到藍(lán)色熒光.這表明探針PIP-ph-PIP在細(xì)胞內(nèi)的毒性較低，在細(xì)胞內(nèi)對(duì)Ag+和Cu2+的熒光響應(yīng)靈敏，可用于細(xì)胞內(nèi)Ag+和Cu2+的檢測(cè).

Fig.8 Fluorescent images of HeLa cells treated with PIP-ph-PIP(10μmol/L)for different concentration(10 and 20μmol/L)of Cu2+and Ag+,respectively(A—E)Bright field image;(F—J)dark field image;(K—O)merged image.(A,F,K)PIP-ph-PIP;(B,G,L)PIP-ph-PIP+Cu2+,10μmol/L;(C,H,M)PIP-ph-PIP+Cu2+,20μmol/L;(D,I,M)PIP-ph-PIP+Ag+,10μmol/L;(E,J,O)PIPph-PIP+Ag+,20μmol/L.

2.5 實(shí)際水樣中Ag+和Cu2+含量的檢測(cè)

為了驗(yàn)證探針PIP-ph-PIP檢測(cè)實(shí)際水樣中Ag+和Cu2+的應(yīng)用能力，采用自來水、齊齊哈爾勞動(dòng)湖水和嫩江水（齊齊哈爾段）作為實(shí)際待測(cè)水樣，通過熒光光譜測(cè)定了實(shí)際水樣中Ag+和Cu2+的濃度.所取水樣經(jīng)過濾漂和除雜后，用Hepes溶液（pH=7.4）稀釋100倍，加入探針PIP-ph-PIP及不同量的Ag+和Cu2+，記錄465 nm處的熒光強(qiáng)度.測(cè)定完成后，用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果列于表1.水樣中Ag+和Cu2+的回收率在93.5%～101.0%之間，誤差較小，精密度較高.同樣采用玻璃電極法檢測(cè)了3種水樣中Ag+和Cu2+的濃度（表S1，見本文支持信息），發(fā)現(xiàn)熒光法檢測(cè)與玻璃電極法檢測(cè)結(jié)果相差不大，表明探針PIP-ph-PIP可用于實(shí)際水樣中Ag+和Cu2+定量檢測(cè)，并具有較高的準(zhǔn)確度和精密度.

Table 1 Determination of Ag+and Cu2+concentrations in real water samples by the fluorescence method based on the PIP-ph-PIP probe

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)并合成了一種對(duì)稱型菲并咪唑熒光探針PIP-ph-PIP，該探針可在水相體系中分別實(shí)現(xiàn)對(duì)Ag+和SCN-以及的ON-OFF-ON連續(xù)識(shí)別.識(shí)別效果既可以通過裸眼比色觀察，也可以通過熒光光譜進(jìn)行測(cè)定.探針PIP-ph-PIP對(duì)Ag+識(shí)別具有超低檢出限（6.1 nmol/L），可用于活體HeLa細(xì)胞中Ag+和Cu2+的定性檢測(cè)，也能實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際水樣中的Ag+和Cu2+的定量檢測(cè).

支持信息見http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210089.