楊凡慧 楊朝鮮 張春銀

1 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，南充 637000；2 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)與分子影像四川省重點實驗室，瀘州 646000；3 西南醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究室，瀘州 646000；4 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，瀘州 646000

腦出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是臨床常見病、多發(fā)病，具有發(fā)病率、病死率、致殘率均高等特點，已成為威脅人類健康的主要疾病之一[1-3]。因此，進行ICH 的早診斷、早治療以及急慢性期病理生理改變的實驗研究是非常重要的[4]。目前，大鼠是構(gòu)建ICH 動物模型最常用的動物之一，研究者常通過神經(jīng)行為學(xué)評分，如神經(jīng)損傷嚴(yán)重缺損評分、平衡木測試、水迷宮測試等方法判斷大鼠的神經(jīng)功能損傷程度，以間接評價大鼠ICH 模型構(gòu)建成功與否，以及評價后期相關(guān)干預(yù)實驗。傳統(tǒng)的神經(jīng)功能損傷評分等方法因其具有間接性和不可避免的主觀性，對評估大鼠ICH 后神經(jīng)功能損傷程度尚有一定局限性[5]。Micro-PET/CT 能清晰、靈敏地顯示腦血腫及其周圍神經(jīng)細(xì)胞的代謝情況，明確病變位置、范圍和大小，為研究ICH 的發(fā)病機制、病理轉(zhuǎn)歸、生理學(xué)改變甚至藥物干預(yù)提供了有效手段。近年來，國內(nèi)外已有一些學(xué)者利用micro-PET/CT 研究ICH[6-7]，但有關(guān)micro-PET/CT 在驗證ICH 模型中的價值的研究少有報道。本研究應(yīng)用18F-FDG micro-PET/CT 動態(tài)觀察大鼠ICH 模型在不同出血時間點腦血腫體積的變化，直接評價大鼠ICH 模型構(gòu)建成功與否以及后期的恢復(fù)情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

采用簡單隨機抽樣法選取32 只健康雄性成年SD 大鼠[原瀘州醫(yī)學(xué)院現(xiàn)西南醫(yī)科大學(xué)動物中心提供, 動物許可證號為SCXK（川）2013-17]，清潔級Ⅱ級，2～3 月齡，體重250～350 g，飼養(yǎng)于無特定病原體級動物房，室溫控制在20～26℃，相對濕度控制在50%～60%。采用簡單隨機抽樣法將大鼠分為假手術(shù)組4 只，ICH 模型組28 只。ICH 模型組建模成功后，按腦出血后時間點將大鼠分為7 個組：6、24、48 h 和3、5、7、14 d，每組4 只。各組大鼠自由進食全價鼠飼料及清潔水，12 h/12 h 明暗交替光照。

1.2 大鼠ICH 模型的構(gòu)建

ICH 模型組參照文獻[8]的方法進行改進，常溫下按照體重給予大鼠1%的戊巴比妥鈉（60 mg/kg），腹腔內(nèi)麻醉，直至淺感覺消失（用鑷子夾尾或眼瞼無反應(yīng)），待呼吸平穩(wěn)后，俯臥位固定頭部于立體定位儀上，保持前囟和后囟在同一水平，頭頂部剪毛、消毒，頭皮正中切口10 mm，將5 μL 微量進樣器固定在定位儀上，以前囟為原點，定位進針（前囟前0.2 mm，頭尾正中線右側(cè)旁開3 mm），并做記號。取下微量進樣器，用顱鉆在記號處鉆孔達(dá)硬腦膜表面。5 μL 微量進樣器抽取膠原酶Ⅳ（購自北京Solarbio 科技有限公司）2 μL（0.125 U/μL），重新固定在頭部立體定位儀上，沿著鉆孔進針，并以顱骨外板為零點垂直進針6 mm。手動緩慢（0.5 μL/min）將膠原酶Ⅳ溶液注入右側(cè)基底節(jié)區(qū)，留針10 min，緩慢退針（0.5 μL/min）。骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮，待大鼠蘇醒后放回飼養(yǎng)籠。假手術(shù)組以0.9%生理鹽水2 μL 代替膠原酶Ⅳ，余操作同ICH 模型組。

1.3 ICH 模型的評價

1.3.1 神經(jīng)功能損傷評分

采用Zea-Longa 5 級評分法[9-10]分別對假手術(shù)組及7 個ICH 模型組（6、24、48 h 和3、5、7、14 d）大鼠行神經(jīng)功能損傷評分。0 分：神經(jīng)功能正常；1 分：輕度神經(jīng)功能缺損（提尾時左前肢屈曲）；2 分：中度神經(jīng)功能缺損（行走時向左側(cè)旋轉(zhuǎn)）；3 分：重度神經(jīng)功能缺損（向左側(cè)傾斜）；4 分：無自發(fā)行走，意識減退。得分越高者說明神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重。

1.3.218F-FDG micro-PET/CT 顯像

使用德國Siemens 公司 Inveon 型micro-PET/CT儀，圖像采集和圖像分析采用IRW 工作站配備的德國Siemens 公司Inveon Acquisition Workplace 及ASIPro VM 軟件和自購PMOD 軟件（平生醫(yī)療科技有限公司）。室溫下按照體重給予假手術(shù)組和7 個ICH 模型組大鼠1%的戊巴比妥鈉（60 mg/kg），腹腔內(nèi)麻醉，麻醉良好后（淺感覺消失），尾靜脈注射18F-FDG（由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科合成，放射化學(xué)純度≥95%）（17.8±0.4） MBq，30 min 后行micro-PET/CT 顯像，保證大鼠顯像前均禁食禁水12 h 以上。PET 采集時間為10 min，同位素選擇F-18，其余參數(shù)選擇系統(tǒng)默認(rèn)（電流500 μA，電壓80 kV，獲取時間600 s，軸向掃描長度127 mm，時間窗3438 ns）；CT 掃描參數(shù)選擇系統(tǒng)默認(rèn)（電流500 μA，電壓80 kV，軸向掃描長度133 mm），數(shù)據(jù)重建采用濾波反投影法（FBP），其余重建參數(shù)選擇系統(tǒng)默認(rèn)（矩陣128×128，圖片縮放1）。

1.4 圖像分析及ROI 法計算腦血腫體積

對圖像進行視覺分析和半定量分析。圖像分析應(yīng)用儀器自帶ASIPro VM 軟件及PMOD 軟件。PET/CT 融合圖像顯示顯像劑分布稀疏或缺失為陽性（患側(cè)與健側(cè)腦攝取比值＜0.5），根據(jù)血腫大小勾畫每個層面的葡萄糖攝取減低或缺損區(qū)邊緣，即ROI，利用micro-PET/CT 自帶的半自動體積測量工具計算ICH 模型組大鼠各時間點的腦血腫體積。以上操作由2 名核醫(yī)學(xué)科副高及以上職稱的醫(yī)師完成。

圖 1 假手術(shù)組大鼠的18F-FDG micro-PET/CT 橫斷位顯像圖顯示大鼠大腦18F-FDG 分布均勻。假手術(shù)組為以0.9%生理鹽水代替膠原酶Ⅳ構(gòu)建的假腦出血模型。FDG 為氟脫氧葡萄糖；PET/CT 為正電子發(fā)射斷層顯像計算機體層攝影術(shù)Figure 1 18F-FDG micro-PET/CT transverse imaging of rats in the sham operation group

1.5 組織病理學(xué)檢查及多田公式計算腦血腫體積

7 個ICH 模型組大鼠在行18F-FDG micro-PET/CT顯像后取腦，將腦組織放入中性甲醛液中固定，5～7 d 后用專用刀片將腦組織沿針尖處切開，觀察腦內(nèi)血腫情況，并用數(shù)碼相機對準(zhǔn)血腫部位拍照。使用專用刀片手動將血腫切片（切片數(shù)為C），層厚約1mm，選擇血腫最大層面測量的長徑（A）和短徑（B，與A 垂直的長徑），并利用多田公式（血腫體積=A×B×C/2）計算腦血腫體積。在利用多田公式計算腦血腫體積時，有效切片中的血腫面積不得小于血腫最大面積的25%，如果切片中血腫面積大于血腫最大面積的75%，則切片數(shù)計為1；如果切片中血腫面積為血腫最大面積的25%～75%，則計為0.5[11-12]。切片的制作及腦血腫體積的計算由2 名本專業(yè)工作滿2 年以上的實驗員完成，分別計算出腦血腫體積，再取平均值。最后對大鼠腦組織行常規(guī)蘇木精-伊紅染色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示。同一種方法的不同時間點計算所得的腦血腫體積的比較采用單因素方差分析；同一時間點18F-FDG micro-PET/CT 勾畫ROI法和多田公式計算所得的腦血腫體積的比較采用配對t檢驗。將2 種方法所得的腦血腫體積行Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能損傷評分結(jié)果

假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)功能損傷評分均為0 分。ICH模型組大鼠在ICH 模型構(gòu)建完成、麻醉蘇醒后均出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)精神癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡不振、食欲欠佳、運動緩慢、左側(cè)肢體癱瘓、行走時向左側(cè)內(nèi)旋轉(zhuǎn)甚至伴有全身震顫等。ICH 后6、24、48 h 和3、5、7、14 d，ICH 模型組大鼠神經(jīng)功能損傷評分分別為（2.21±0.30）、（3.51±0.66）、（2.83±0.20）分和（2.12±0.50）、（1.44±0.37）、（1.02±0.25）、（0.51±0.12）分，其中24 h 的評分最高，之后隨著時間的推移大鼠神經(jīng)功能開始逐漸恢復(fù)。

2.2 18F-FDG micro-PET/CT 顯像結(jié)果

（1）視覺分析結(jié)果：18F-FDG micro-PET/CT 顯像示假手術(shù)組大鼠大腦的18F-FDG 分布均勻，典型圖像見圖1。ICH 模型組大鼠各個時間點大腦右側(cè)基底節(jié)區(qū)18F-FDG 攝取均減低或缺損（即血腫部位）（圖2A），且與大鼠解剖后腦組織血腫區(qū)域相對應(yīng)（圖2B）。（2）半定量分析結(jié)果：ICH 模型組大鼠在ICH 后各個時間點micro-PET/CT 勾畫ROI 法測得的腦血腫體積的結(jié)果見表1，其中24 h 腦血腫體積最大，之后隨著出血時間的推移腦血腫體積開始逐漸縮??；24 h 腦血腫體積與6、48 h 腦血腫體積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.27，P＞0.05），與3、5、7、14 d 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=29.65，P＜0.05）。

圖 2 腦出血模型組大鼠18F-FDG micro-PET/CT 橫斷位顯像圖（A）與腦血腫解剖圖（B） A 圖顯示大鼠大腦右側(cè)基底節(jié)區(qū)見不規(guī)則狀18F-FDG 攝取減低及缺損區(qū)（箭頭所示），其位置、形態(tài)、大小與B 圖大體解剖的血腫基本一致（箭頭所示）。FDG 為氟脫氧葡萄糖；PET/CT 為正電子發(fā)射斷層顯像計算機體層攝影術(shù)Figure 2 18F-FDG micro-PET/CT transverse imaging (A) and cerebral hematoma anatomical topography (B) of rats in the intracerebral hemorrhage model group

表 1 2 種方法測得的腦出血模型組大鼠在腦出血后不同時間點腦血腫體積的比較[（ ±s） mm3，n=4]Table 1 Comparison of cerebral hematoma volume measured by two methods in rats in the intracerebral hemorrhage model group at different time points after intracerebral hemorrhage [（ ±s）mm3，n=4]

表 1 2 種方法測得的腦出血模型組大鼠在腦出血后不同時間點腦血腫體積的比較[（ ±s） mm3，n=4]Table 1 Comparison of cerebral hematoma volume measured by two methods in rats in the intracerebral hemorrhage model group at different time points after intracerebral hemorrhage [（ ±s）mm3，n=4]

注：PET/CT 為正電子發(fā)射斷層顯像計算機體層攝影術(shù)；多田公式為A×B×C/2（A 和B 分別為血腫最大層面測量的長徑和短徑；C 為血腫切片數(shù)）

方法 6 h 24 h 48 h 3 d 5 d 7 d 14 d micro-PET/CT勾畫ROI法24.05±3.00 27.19±1.25 25.58±1.57 21.94±0.98 19.88±1.53 18.35±2.11 16.29±1.53多田公式 23.17±1.93 26.09±1.35 24.64±1.95 21.31±1.32 19.07±1.64 17.29±1.38 15.63±1.98 t 值 1.58 1.18 3.06 1.80 2.21 2.84 1.91 P值 0.21 0.32 0.06 0.17 0.11 0.07 0.15

2.3 組織病理學(xué)檢查

ICH 模型組在各個時間點解剖后，大腦右側(cè)基底節(jié)區(qū)均可見不規(guī)則的血腫形成，與18F-FDG micro-PET/CT 顯示的放射性稀疏及缺損區(qū)相對應(yīng)。而且隨著出血后時間的延長，腦血腫體積逐漸縮小。典型的大鼠腦血腫解剖圖見圖2B。圖3 示腦組織血腫內(nèi)大量彌漫分布的紅細(xì)胞。

圖 3 腦出血模型組大鼠出血后7 d 的組織病理學(xué)檢查圖（蘇木精-伊紅染色，×100） 顯示腦組織內(nèi)可見大量彌漫分布的紅細(xì)胞（箭頭所示）Figure 3 Histopathological examination of rat in the intracerebral hemorrhage model group 7 d after intracerebral hemorrhage (hematoxylin-eosin staining, ×100)

2.4 Micro-PET/CT 勾畫ROI 法和多田公式測得的ICH 大鼠腦血腫體積的比較結(jié)果

Micro-PET/CT 勾畫ROI 法和多田公式測得的ICH 大鼠各個時間點的腦血腫體積的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05，表1）；2 種方法測得的腦血腫體積呈顯著正相關(guān)（r=0.99，P＜0.001）。

3 討論

ICH 已成為威脅人類健康及生活質(zhì)量的重要事件之一。隨著醫(yī)學(xué)界對ICH 組織學(xué)、病理生理學(xué)研究的深入，研究者們不但需要穩(wěn)定的ICH 動物模型， 同時還需要可靠的活體驗證ICH 模型的方法和手段， 以便得出可靠的數(shù)據(jù)和可信的結(jié)果。Micro-PET/CT 是專門為研究人類疾病的小動物模型而設(shè)計的臨床前影像設(shè)備，其能提供給研究者一個與人體相似的活體分子影像，解決模擬人體的活體實驗問題，被譽為是生命的斷層顯像技術(shù)[13]。18F-FDG 可通過血腦屏障被腦細(xì)胞攝取，其攝取量與該部位葡萄糖代謝水平息息相關(guān)。葡萄糖是腦內(nèi)最主要的供能物質(zhì)，其代謝水平與神經(jīng)元的活動程度關(guān)系密切[14]。ICH 后，病灶部位代謝水平與神經(jīng)元的活動度降低，18F-FDG micro-PET/CT 顯像顯示腦血腫表現(xiàn)為顯像劑攝取稀疏甚至缺損，根據(jù)糖代謝水平的差異可以反映腦血腫的位置、大小和形狀[6]。

本研究使用micro-PET/CT 對大鼠ICH 模型進行顯像，克服了小動物影像學(xué)檢查的難題，其掃描速度快，靈敏度和空間分辨率高（PET 靈敏度＞10%、空間分辨率1.4 mm；CT 最大分辨率20 μm），后處理軟件豐富。本研究結(jié)果表明，micro-PET/CT勾畫ROI 法與多田公式所得的ICH 模型組各個時間點腦血腫體積的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；18F-FDG micro-PET/CT 顯示的放射性稀疏及缺損區(qū)與大鼠解剖后腦組織血腫區(qū)域相對應(yīng)，這足以說明不同時間點的micro-PET/CT 融合圖像可以很好地顯示腦血腫的位置、大小、形狀。神經(jīng)功能損傷評分示ICH 模型組24 h 的評分最高，之后隨著時間的推移大鼠神經(jīng)功能開始逐漸恢復(fù)，與18F-FDG micro-PET/CT 顯示的ICH 情況大致相符，但是3 d 后神經(jīng)功能損傷評分已非常接近（均低于2 分），其得分結(jié)果很容易受主觀因素的影響，而18F-FDG micro-PET/CT 顯像通過客觀數(shù)據(jù)顯示，ICH 模型組3 d后腦血腫的大小仍在不斷地發(fā)展變化。由此可見，關(guān)于神經(jīng)功能損傷的一些神經(jīng)生物學(xué)評分對評價ICH 后神經(jīng)功能損傷程度甚至治療干預(yù)后神經(jīng)功能恢復(fù)情況尚有一定局限性，而18F-FDG micro-PET/CT顯像則可長期動態(tài)觀察活體大鼠ICH后腦血腫大小的演變情況。付懷棟等[15]的研究結(jié)果也表明，神經(jīng)功能損傷評分用來判斷ICH 模型是否構(gòu)建成功具有不確定性。Micro-PET/CT 適合的對象為小型呲齒類動物（小鼠或大鼠），其不但能穩(wěn)定、可靠地檢測出ICH 模型是否構(gòu)建成功，而且能很好地顯示腦血腫的位置、形狀及大小，得出的結(jié)果直觀、可靠，還可以進一步進行大鼠ICH藥物治療后腦血腫及周圍腦組織功能代謝演變等方面的研究。且已有一些研究者應(yīng)用PET 或PET/CT評價ICH 動物模型腦的糖代謝變化及藥物干預(yù)后的療效，均取得了很好的結(jié)果[7，16-17]。

綜上所述，18F-FDG micro-PET/CT 活體驗證大鼠ICH 后腦血腫的位置、形狀、大小是可行可靠的，這也是眾多研究者利用micro-PET/CT 研究ICH 的重要基礎(chǔ)，與神經(jīng)功能損傷評分相互補充，能更好地評估大鼠ICH 后神經(jīng)功能損傷程度及恢復(fù)后的改變情況，其可以作為大鼠ICH 模型評價的新型手段，這也為臨床18F-FDG PET/CT 應(yīng)用于ICH 的診斷及指導(dǎo)治療決策提供幫助。

利益沖突本研究由署名作者按以下貢獻聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻聲明楊凡慧負(fù)責(zé)現(xiàn)場的實驗、論文的撰寫；楊朝鮮負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)及圖像的處理與分析；張春銀負(fù)責(zé)方法的建立、論文的審閱。