張暢(國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作廣東中心，廣東 廣州 510000)

1 概述

目前常用的材料表面改性方法主要有表面涂覆、等離子體化和表面接枝。前兩者雖然方法簡(jiǎn)單，但是改性后材料性能不穩(wěn)定，因此表面接枝是當(dāng)今人們比較常用的改善材料血液相容性的一種方法。但一般的表面接枝方法得到的接枝表面結(jié)構(gòu)不統(tǒng)一，接枝密度和接枝鏈長(zhǎng)都不能很好地控制，隨著ATRP[1]技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸開(kāi)始采用表面引發(fā)ATRP(SI-ATRP)的方法在材料表面可控的接枝上具有生物活性的單體。目前接枝到材料表面的生物活性分子主要有以下四種：聚乙二醇類、磷酰膽堿類、內(nèi)鹽類、肝素類。在材料表面接枝的第一步就是要在其表面引入合適的引發(fā)基團(tuán)，但是合成材料中，一般都不具有可以用于ATRP引發(fā)的基團(tuán)。因此進(jìn)行表面引發(fā)ATRP之前要先在材料表面引入引發(fā)劑。

雖然氨基在材料表面很少見(jiàn)，但也有，比如殼聚糖，但是材料表面一般存在有羥基基團(tuán)。像纖維素膜[2]、紙和NH2-玻璃片[3]等都是存在羥基基團(tuán)的基底，它們可以直接與2-溴異丁酰溴和三乙胺反應(yīng)而使表面帶上溴酯或溴氨等引發(fā)基團(tuán)。但是對(duì)于那些表面沒(méi)有羥基基團(tuán)的材料，就需要先引入羥基基團(tuán)。如，尼龍膜就可以被甲醛活化而在表面帶上羥基，又如，利用紫外輻照可以在聚丙烯的表面引入用于SI-ATRP的活性基團(tuán)：用于紫外引發(fā)劑的二苯甲酮-2-溴異丁酰鹽是由4-羥基二苯甲酮和2-溴異丁酰溴制備，將其涂覆到PP的表面，然后再波長(zhǎng)為365 nm紫外光照射下處理(如圖1所示)[4]。

2 常用研究方法

2.1 水接觸角測(cè)量

提高材料的親水性，可以降低其與血液之間的界面粘附功，界面粘附功越低，材料表面吸附的蛋白質(zhì)及血小板越容易發(fā)生解吸附。因此，提高材料親水性能有效改善材料血液相容性。親水性通常是用材料表面的水接觸角及材料平衡態(tài)吸水性來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。水接觸角通常用于材料表面親水性的評(píng)價(jià)，其測(cè)量方法一般分為測(cè)角法、測(cè)高法和測(cè)重法，其中測(cè)角法應(yīng)用最廣。測(cè)角法根據(jù)測(cè)試方式的不同可以分為鼓泡模式和平滴模式，根據(jù)測(cè)試過(guò)程液滴的滴定模式可以分為靜態(tài)接觸角和動(dòng)態(tài)接觸角(包括前進(jìn)角和后退角)。對(duì)于鼓泡模式來(lái)說(shuō)親水性越強(qiáng)，接觸角越大：而對(duì)于平滴模式來(lái)說(shuō)接觸角越小，親水性越強(qiáng)。

Feng等[5]將MPC用表面引發(fā)ATRP和引發(fā)劑自組裝的方法接枝到硅片的表面，制備了接枝密度為0.06～0.39 chains/nm2和鏈長(zhǎng)為5～200個(gè)單體單元的接枝樣品。并測(cè)定了不同接枝密度和接枝鏈長(zhǎng)接觸角的變化(如圖2所示)

圖2 不同接枝鏈長(zhǎng)和接枝密度的表面接枝MPC樣品的前進(jìn)角

2.2 蛋白質(zhì)吸附研究

通常情況下，生物材料與血液接觸后水分和無(wú)機(jī)鹽最先到達(dá)材料表面，緊接著是體液、血液中的蛋白質(zhì)分子，最后是血小板、細(xì)胞等到達(dá)材料表面。血小板、血細(xì)胞通過(guò)蛋白質(zhì)層粘附到生物材料的表面，因此材料血液相容性與材料對(duì)蛋白質(zhì)吸附性能密切相關(guān)，材料表面吸附蛋白質(zhì)的種類、吸附速度、吸附類型、吸附量以及空間構(gòu)象都直接影響材料的血液相容性。

蛋白質(zhì)的吸附尤其是血漿蛋白在高分子材料表面的吸附對(duì)于凝血和溶血的發(fā)生有著至關(guān)重要的作用。吸附在材料上的蛋白質(zhì)可以催化或削弱血液與材料的作用，最終影響材料的血液相容性。因此，全面定量地理解蛋白質(zhì)從復(fù)雜的溶液中如何到達(dá)、吸附在生物材料表面是未來(lái)生物材料設(shè)計(jì)的關(guān)鍵課題。

白蛋白(albumin)作為一種血液相容性輔助單體得到廣泛的研究和應(yīng)用。白蛋白是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，研究表明，白蛋白可以運(yùn)輸血液中的許多小分子，是維持血液滲透壓最重要的物質(zhì)，且不會(huì)引起體液和細(xì)胞體的免疫反應(yīng)。牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)是最常被用來(lái)研究的一種白蛋白，形狀為橢球形，尺寸大小為14 nm×4 nm×4 nm。它是具有水溶性天然高分子，有著合成材料所無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)且可用于改善材料血液相容性。通常將血清白蛋白(鈍化材料吸附的蛋白)，纖維蛋白原(活化材料吸附的蛋白)和溶菌酶(在生理環(huán)境下顯正電性的蛋白)的吸附行為作為材料抗蛋白吸附性能的評(píng)價(jià)。材料表面蛋白質(zhì)吸附的數(shù)量、組成和構(gòu)象可以通過(guò)圓二色譜法(CD)、差示掃描法(DSC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、石英微天平(QCM)、放射元素?zé)晒夥治龇?、BCA蛋白質(zhì)定量分析法進(jìn)行測(cè)試。

JIN等[6]通過(guò)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)方法將甲基丙烯酸甲氧基聚乙二醇(poly(OEGMA))接枝到聚氨酯的表面，通過(guò)單體濃度，接枝引發(fā)時(shí)間來(lái)調(diào)控接枝分子刷鏈長(zhǎng)和接枝密度，并通過(guò)蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)(纖維蛋白原、溶菌酶和乳白蛋白)對(duì)其抗蛋白吸附性能進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改性后的材料抗蛋白質(zhì)吸附能力增強(qiáng)。隨著接枝分子鏈增加，抗蛋白質(zhì)吸附能力逐漸增加(在100個(gè)單體接枝單元內(nèi))，同時(shí)實(shí)驗(yàn)也考查了混合蛋白溶液體系下的抗蛋白質(zhì)吸附能力。研究證明在二元蛋白質(zhì)混合體系下，改性材料同樣具有優(yōu)異抗蛋白吸附性能。盡管聚乙二醇類材料具有優(yōu)良的抗蛋白質(zhì)吸附性能和良好的血液相容性，卻存在抗氧化能力差(特別是在過(guò)渡金屬存在下)、容易降解等缺點(diǎn)，不利于其作為生物相容性材料長(zhǎng)期使用。

2.3 血小板粘附、激活研究

蛋白質(zhì)在生物材料表面吸附、沉積后可被血液中的血小板識(shí)別，引起血小板的粘附、鋪展和激活等反應(yīng)。其中血液中纖維蛋白原、玻連蛋白、免疫球蛋白、von Willebrand因子等都對(duì)血小板的粘附激活有重要影響。其中纖維蛋白原對(duì)血小板的粘附影響最大，而玻連蛋白、免疫球蛋白、von Willebrand因子主要對(duì)血小板起促進(jìn)激活的作用。血小板粘附后受激活會(huì)釋放出二磷酸腺苷(ADP)、血栓素A2和血清素等物質(zhì)，這些物質(zhì)進(jìn)一步地活化血小板并促進(jìn)凝血酶釋放出來(lái)。不溶性的纖維蛋白質(zhì)多聚體可連同血小板、血細(xì)胞、白細(xì)胞一起發(fā)生聚集，最終形成血栓。血小板在材料表面粘附、激活狀態(tài)的不同能反映出材料血液相容性的差異。因此通過(guò)測(cè)試材料表面吸附血小板數(shù)量及其結(jié)構(gòu)狀態(tài)也是評(píng)價(jià)材料血液相容性的一種有效方法。

Xu等[7]用表面引發(fā)ATRP的方法將PEGMA先接枝到硅片的表面，從而在硅片的表面得到一層密實(shí)的PEGMA覆蓋層。然后利用ATRP反應(yīng)后PEGMA末端帶的端基-Cl與肝素反應(yīng)將肝素接枝上去，這樣得到的肝素接枝量可以達(dá)到很高(約14 μg/cm2)，如圖3所示。接枝后的表面對(duì)蛋白質(zhì)吸附和血小板粘附有顯著的抑制作用，同時(shí)呈現(xiàn)出很好的抗凝血性能(血液再鈣化時(shí)間約150 min)。他們認(rèn)為，接枝后的肝素之所以得以保持其良好的生物活性，是由于PEGMA擁有好的生物相容性，且它作為間隔臂為肝素在親水環(huán)境下提供了高的構(gòu)象自由度。

圖3 Si-g-PEGMA-g-Heparin的制備過(guò)程

2.4 細(xì)胞相容性研究

通過(guò)測(cè)試材料表面對(duì)細(xì)胞粘附的抵抗情況以及細(xì)胞粘附后形態(tài)的變化等也是評(píng)價(jià)材料血液相容性的一種有效手段。

Singh等[8]通過(guò)SI-ATRP和硫醇分子自組裝的方法在金的表面制備了納米厚度的PEGMA聚合物刷子。分別研究了材料表面接枝密度和接枝鏈長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞粘附的影響，發(fā)現(xiàn)接枝了刷子狀聚合物(接枝密度大)的表面更能抗細(xì)胞粘附。

3 結(jié)語(yǔ)

血漿蛋白、血小板以及細(xì)胞在高分子材料表面的吸附對(duì)于材料誘發(fā)凝血都有著非常重要的作用，研究蛋白質(zhì)、血小板以及細(xì)胞與材料表界面之間的相互作用機(jī)制對(duì)于制備出高性能血液相容性材料具有指導(dǎo)意義，通過(guò)以上研究可以有效評(píng)價(jià)改性材料與血液直接接觸后是否引發(fā)血小板聚集、凝血及血栓形成和溶血現(xiàn)象等問(wèn)題。