吳玉清王永會李祥宋新賀李媛羅輯趙遠

(1.鴻灌環(huán)境技術(shù)有限公司，江蘇 蘇州 215200；2.蘇州市吳江生態(tài)環(huán)境局，江蘇 蘇州 215200；3.常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州 213164)

近年來，隨著工業(yè)的快速發(fā)展，人口的急劇增加，土壤污染日益嚴(yán)重，包括固體、液體污染物向自然界堆放和排放現(xiàn)象嚴(yán)重，有害的廢水滲透，以及隨雨水落入土壤的有害物質(zhì)[1]。其中染料污染尤為突出，這些污染影響微生物的生命活動，導(dǎo)致土壤系統(tǒng)因能量流動變慢而不斷惡化，同時部分有害物質(zhì)由富集作用進入人體間接影響人的身體健康。目前，染料污染已成為世界公害之一，每年全世界有大量染料垃圾進入環(huán)境，污染土壤、地下水、河流和海洋。染料對土壤的污染主要是有機物染料在土壤中能夠長期殘留，破壞土壤結(jié)構(gòu)，影響土壤通透性[2]。同時，污染物會進入食物鏈最終危及人類健康。染料污染物在自然界很難被有效降解，傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法不僅操作麻煩，投資巨大，處理效率低下，且存在二次污染，而微生物處理污染物技術(shù)具有處理速度快、消耗低、效率高、成本低、反應(yīng)條件溫和且無二次污染等顯著優(yōu)點[3]，加之其技術(shù)開發(fā)具有廣闊的市場前景，各國政府、科研工作者和企業(yè)家對此高度重視，而且目前對降解染料污染物的菌類研究較少，因此篩選染料廠遺址土壤中的微生物具有重要意義。

本次研究取樣于江蘇省泰興市黃橋鎮(zhèn)南沙社區(qū)染料污染遺址土壤，該區(qū)域為《土壤污染防治行動計劃》擬在全國啟動200個土壤污染治理修復(fù)試點示范項目的先期啟動試點項目區(qū)域。該區(qū)域由于長期工業(yè)生產(chǎn)活動，土壤中多種重金屬明顯累積并超過背景水平和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。項目區(qū)染料等固廢處置和廢水排放，導(dǎo)致周邊耕地、農(nóng)田地灌溉水源地河道和水體受污染，土壤和灌溉水污染直接威脅著農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，危害人體健康，該項目的開展刻不容緩。

1 土壤微生物分離、純化

土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某些微生物的特征則需要把目的菌從混雜的微生物中分離出來，這種獲得單一純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化[4]。微生物代謝速度快，容易變異，因此在分離純化后需要進行菌株保存。

最常用的方法是稀釋涂布法和平板劃線法。如果需要分離的微生物在微生物群體中的數(shù)量較少或生長過慢，則需要使用選擇培養(yǎng)基，通過改變微生物在群體中的比例達到篩選的目的[5]。

本實驗將從染料廠遺址不同地方3份土樣(2份染料出口下方土樣和1份垃圾堆附近土樣)中篩選出幾株特征明顯的不同種類的純培養(yǎng)并進行菌種的保存。

1.1 實驗方法

本實驗是篩選純化染料廠遺址土壤微生物，得到微生物的純培養(yǎng)，主要是在稀釋涂布法的基礎(chǔ)上進一步使用平板劃線法得到單一菌落。

1.2 實驗結(jié)果與分析

通過傳統(tǒng)的篩選方法共篩選得到11株純培養(yǎng)。3個土樣(E2、E3、E4)經(jīng)梯度稀釋涂布分離得到菌落形態(tài)可知，在同等培養(yǎng)條件下，E3土樣內(nèi)微生物含量低于E2和E4。進一步平板劃線培養(yǎng)，得到11株形態(tài)差異較大特征明顯的純培養(yǎng)，對應(yīng)其采集土壤分別編號為E21、E22、E23、E24、E31、E32、E33、E41、E42、E43和E44，其特征如表2。其中幾種菌(E21、E33、E42)平板劃線后培養(yǎng)得到的菌落形態(tài)如圖1～3所示。

由實驗結(jié)果可以看出，在每個培養(yǎng)基中，劃線的最后部分均有單個菌落出現(xiàn)，即說明分離純化得到了純培養(yǎng)。

2 革蘭氏染色

革蘭氏染色法[6](Gram stain procedure)是1884年丹麥病理學(xué)家Christain Gram創(chuàng)立的，之后在一些學(xué)者不斷改進下成為細菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色的目的是判斷分離、純化的土壤菌為革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌，同時可以通過染色觀察菌的微觀性質(zhì)。

2.1 實驗方法

土壤經(jīng)梯度稀釋涂布、劃線分離、純化實驗得到菌落特征差異較大的11種土壤細菌，革蘭氏染色，數(shù)碼生物顯微鏡下觀察、拍照并記錄結(jié)果。

2.2 實驗結(jié)果與分析

通過革蘭氏染色實驗得出11株菌的性質(zhì)。經(jīng)梯度稀釋涂布、劃線分離、純化實驗得到菌落特征差異較大的11株菌株細胞經(jīng)革蘭氏染色后，在數(shù)碼生物顯微鏡下觀察拍攝照片，細菌形態(tài)如圖4～14所示。

由拍攝照片可看出，11株菌均被染成紫色，說明此次篩選得到的細菌均為革蘭氏陽性菌(G+)。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，E21為兩端半圓形的桿菌，有居中不膨大的芽孢，存在細胞莢膜，成對排列；E22為弧菌，無芽孢，也不存在細胞莢膜，單個排列；E23為單個或成對排列的橢球形菌，存在莢膜，無芽孢；E24為兩端半圓形的鏈桿狀菌，有莢膜，無芽孢存在；E31為單個或成對排列的橢球形菌，有莢膜存在，無芽孢；E32為有莢膜，無芽孢，多個排列在一起呈鏈狀的橢球形菌；E33為兩端略尖形，無莢膜，無芽孢的棒桿狀菌；E41為多個排列在一起呈鏈狀的有莢膜無芽孢的球菌；E42為有莢膜，無芽孢，單個或成對排列的球形菌；E43為橢球形菌，多個不規(guī)則排列在一起，但非鏈狀，有莢膜，無芽孢；E44為有莢膜，無芽孢，單個過成對排列的橢球形菌[6]。

3 生理生化實驗

傳統(tǒng)的微生物鑒定方法就是利用其生理生化特性，且微生物的生理生化特征能夠表明該微生物在某些方面的特性，而這些特性能夠為其實際應(yīng)用提供參考價值。

3.1 甲基紅(M·R)實驗

微生物在生長代謝過程中將葡萄糖分解為丙酮酸，有些微生物能夠進一步將丙酮酸轉(zhuǎn)化為甲酸、乙酸等，使pH降低，當(dāng)pH低于4.2時，加入甲基紅指示劑，若變?yōu)榧t色，則該菌為甲基紅陽性菌；如微生物分解葡萄糖產(chǎn)酸量少或不產(chǎn)酸，培養(yǎng)基pH在5.4以上，加入甲基紅指示劑呈桔黃色或不變色，則該菌為甲基紅陰性菌[7]。

通過甲基紅試驗得出11株菌的產(chǎn)酸性。培養(yǎng)的菌液及空白對照培養(yǎng)基加入白色比色瓷盤內(nèi)，滴加適量甲基紅指示劑后，E21、E22、E23、E31和E33與對照組對比顏色無變化；E32和E43在滴加指示劑后變?yōu)槌赛S色；E24、E41、E42和E44表現(xiàn)為紅色。部分結(jié)果如圖15～17所示，其中1為實驗組，2為對照組。

根據(jù)實驗結(jié)果可知，E24、E41、E42和E44為甲基紅陽性，其余為甲基紅陰性。

3.2 過氧化氫酶實驗

某些微生物中含有過氧化氫酶，能催化H2O2分解成H2O和O2而有氣泡產(chǎn)生，由此反應(yīng)可知受檢菌是否含有過氧化氫酶[8]。

通過過氧化氫酶試驗得出菌的過氧化氫酶性質(zhì)。向11株菌苔上滴加30%H2O2后，E21、E32、E41和E42明顯產(chǎn)生氣泡，說明這幾種菌皆含有過氧化氫酶，即為過氧化氫酶陽性；其余E22、E23、E24、E31、E33、E43和E44不產(chǎn)生氣泡，說明這幾種菌不含有過氧化氫酶，為過氧化氫酶陰性。

3.3 氧化酶實驗

氧化酶在有分子氧及細胞色素C存在時可氧化鹽酸對氨基二甲基苯胺，使之呈玫瑰紅到暗紫紅色。由此反應(yīng)可知受檢菌是否具有細胞色素氧化酶[8]。

通過檢驗試紙得出氧化酶性質(zhì)。挑取受檢菌于氧化酶試紙上，觀察發(fā)現(xiàn)，E21、E22、E24、E31、E32、E33、E41、E42和E44在10s變紅，說明這些菌均為氧化酶陽性菌，其余的E23和E43為顯示紅色，表明這些菌為氧化酶陰性菌。

3.4 實驗結(jié)果與分析

經(jīng)過甲基紅實驗、氧化酶試驗以及過氧化氫酶試驗結(jié)果可得出11株純培養(yǎng)的生理生化性質(zhì)，結(jié)果如表2所示。

表2 生理生化性質(zhì)

結(jié)合細菌篩選后得到的菌落特征，革蘭氏染色特征以及生理生化試驗結(jié)果，查閱《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對得到的菌株進行傳統(tǒng)方法的鑒定，可以得出，E21可能為巨大芽孢桿菌屬；E22為弧菌；E23可能為乳球菌屬；E24可能為球桿菌屬；E31可能為孿生球菌屬；E32可能為鹽水球菌屬；E33可能為微小桿菌屬；E41可能為糖球菌屬；E42可能為嗜熱糖球菌；E43可能為片球菌屬；E44可能為明串球菌屬[9]。

4 總DNA的提取

為了將分離、純化出的E21、E22、E23、E24、E31、E32、E33、E41、E42、E43和E44 11種菌進行鑒定及進一步研究。使用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離、純化得到的11株細菌的總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳確定提取效果。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)使不同大小的DNA分子遷移速度不同而分層，把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進行電泳即可達到檢測的目的[10]。

通過DNA提取試劑盒提取得到11株菌的DNA，將提取DNA的進行瓊脂糖凝膠電泳采用凝膠成像系統(tǒng)在紫外燈下觀察拍照，如圖18所示。

其中，0泳道為NormalRunTM 250bp-Ⅳ DNA ladder產(chǎn)生的跑膠條帶，1～11泳道分別為E21、E22、E23、E24、E31、E32、E33、E41、E42、E43、E44的DNA跑膠條帶，其中8和9電泳條帶清晰，說明土壤菌E41和E42提取得到的DNA純度較高，其余均有或明或暗的條帶，說明其它菌提取得到的DNA可能含有雜質(zhì)或者提取得到的DNA的量較少，由DNA maker提供的堿基對數(shù)可知，此次提取的DNA亮度條帶位置在15000bp左右。

5 細菌菌屬的鑒定

為了進一步確定篩選得到的微生物的菌屬，從染料廠遺址土壤中分離得到特征明顯的11株細菌(編號分別為E21、E22、E23、E24、E31、E32、E33、E41、E42、E43、E44)，在經(jīng)過傳統(tǒng)方法鑒定后，進一步采用分子生物學(xué)鑒定方法來明確其中幾株細菌的種屬。

通過PCR擴增的多個循環(huán)，將DNA由少量指數(shù)式增長得到大量DNA，通過DNA監(jiān)測公司測序得到堿基序列，登陸http://www.ncbi.nlm.nih.gov，將基因序列與BLAST數(shù)據(jù)庫中序列進行序列分析比較，同時用MEGA5軟件，構(gòu)建Neighbor-Joining樹，確定菌屬[11]。

通過PCR擴增DNA，對其進行瓊脂凝膠糖電泳實驗，紫外燈下拍攝照片，結(jié)果如圖19所示。其中，0泳道對應(yīng)為DNA maker 跑膠后產(chǎn)生的條帶，1～11泳道分別對應(yīng)PCR擴增E21、E22、E23、E24、E31、E32、E33、E41、E42、E43、E44的DNA跑膠后產(chǎn)生的條帶。由圖片可知，11株DNA的PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳條帶清晰，對應(yīng)位置約在200bp左右，為DNA的基因片段[12]。

將其中的E21、E42進行測序，得到其基因片段序列。登陸序列比對網(wǎng)站NCBI，將E21和E42的基因片段序列與BLAST中的16srDNA序列進行序列分析比對，并與GenBank中已發(fā)表的16srDNA序列進行同源性比較，結(jié)果見表3、4。

表3 菌株E21的16s rDNA序列BLAST結(jié)果

表4 菌株E42的16s rDNA序列BLAST結(jié)果

取得E21和E42的DNA相關(guān)序列的登記號和對應(yīng)的堿基序列，利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖20、21所示。

由圖20中E21系統(tǒng)進化樹可知，E21菌株和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)親緣關(guān)系較近，與芽孢桿菌sp.B-jedd、sp.MT2及sp.FF4(Bacillus sp.B-jedd and Bacillus sp.MT2 and Bacillus sp.FF4)、psy芽孢桿菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)有一定的親緣關(guān)系，與新種芽孢桿菌FJAT-14515(Bacillus cihuensis strain FJAT-14515)、中度嗜鹽菌BH030062(Pontibacillus chungwhensis BH030062)等親緣關(guān)系較遠[13]。

由圖21中E42系統(tǒng)進化樹可知，E42菌株和泛菌屬(Pantoea spI12)親緣關(guān)系較近，與腸桿菌屬(Enterobacter sp.FF18)有一定的親緣關(guān)系，與芽孢桿菌sp.HB-2(Bacillus sp.HB-2)等親緣關(guān)系較遠。

根據(jù)分子生物學(xué)方法得到結(jié)果表明，E21與巨大芽孢桿菌親緣關(guān)系較近，與傳統(tǒng)鑒定方法得到結(jié)果一致；E42與泛菌屬親緣關(guān)系較近，與傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果為嗜熱糖球菌有一定出入，因為傳統(tǒng)方法鑒定具有一定的局限性。

6 結(jié)論

本實驗通過對泰興某染料廠遺址土樣篩選純化共得到11株純培養(yǎng)。分別對這些純培養(yǎng)進行革蘭氏染色及幾種傳統(tǒng)的生理生化性質(zhì)分析，提取DNA并用分子生物學(xué)的方法對其中幾種進行同源性分析，鑒定菌屬，為研究微生物治理修復(fù)染料污染提供實驗經(jīng)驗。

通過傳統(tǒng)的微生物篩選方法從3份土壤中共篩選、分離純化共得到11株特征明顯的細菌純培養(yǎng)。通過革蘭氏染色實驗得到菌的微觀特征及革蘭氏性質(zhì)，結(jié)果表明，E21、E33為短桿狀革蘭氏陽性菌，E22為長桿狀革蘭氏陽性菌，E23、E24、E31、E32、E43、E44為橢圓形革蘭氏陽性菌，E41、E42為圓形革蘭氏陽性菌。

通過幾種生理生化反應(yīng)對這些純培養(yǎng)進行分析。氧化酶試驗結(jié)果顯示，E41、E21、E24、E31、E32、E33、E41、E42、E44為氧化酶陽性，E22、E23、E43為氧化酶陰性；甲基紅試驗結(jié)果得出，E24、E41、E42、E44為甲基紅陽性，E21、E22、E23、E31、E32、E33、E43為甲基紅陰性；過氧化氫酶試驗結(jié)果表明，E21、E32、E41、E42為過氧化氫酶陽性，E22、E23、E24、E31、E33、E43、E44為過氧化氫酶陰性。

通過傳統(tǒng)方法，查閱《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對得到的菌株進行傳統(tǒng)方法的鑒定，可以得出，E21可能為巨大芽孢桿菌屬；E22為弧菌；E23可能為乳球菌屬；E24可能為球桿菌屬；E31可能為孿生球菌屬；E32可能為鹽水球菌屬；E33可能為微小桿菌屬；E41可能為糖球菌屬；E42可能為嗜熱糖球菌；E43可能為片球菌屬；E44可能為明串球菌屬。

通過分子生物學(xué)技術(shù)成功鑒定了2株菌株。對提取得到11株菌的DNA進行PCR擴增，選擇其中2個擴增后的產(chǎn)物送去基因公司測序，與NCBI中數(shù)據(jù)庫比對，利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)樹，發(fā)現(xiàn)E21和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)親緣關(guān)系最近，E42與泛菌屬(Pantoea sp.I12)親緣關(guān)系最近。