安星宇李海黃露李淳吳石平

(1.貴州省農業(yè)科學院植物保護研究所，貴州 貴陽 550006；2.織金縣植保植檢站，貴州 織金 552100)

櫻桃(Prunus avium L.)果實色澤紅艷，味道甘甜而微酸，深受消費者的喜愛。近年來，隨著我國人民消費水平不斷提高，櫻桃消費量呈現(xiàn)快速增加的趨勢[1]。櫻桃最早起源于我國，已經有3000多年的栽培歷史，目前廣泛分布于我國西南及華北地區(qū)[2]，國內櫻桃產量由2014年的3.45萬t上升到2018年的80余萬t，4a間增長超過20多倍，使得我國超越土耳其，成為世界第一大櫻桃生產國[3]。貴州屬于亞熱帶季風氣候，非常適于喜高溫、高濕的櫻桃生長。目前，貴州省櫻桃種植區(qū)主要分布在中部、西北部和北部，包括貴陽市、安順市、畢節(jié)市和遵義市，櫻桃作為特色果樹產業(yè)，在貴州農業(yè)產業(yè)結構調整的大背景下，種植規(guī)模得到迅速擴大[4]。至2020年，全省櫻桃總種植面積高達3.48萬hm2，同比增長6.72%。然而隨著櫻桃種植面積的擴大，病蟲害的危害程度也日益加重，其中危害櫻桃葉、花、新梢、果實的褐腐病在貴州種植區(qū)發(fā)生嚴重，嚴重影響了當?shù)貦烟业漠a量和品質，成為櫻桃生產上的主要病害之一[5]。櫻桃褐腐病又稱菌核病、灰腐病等，是一種世界性病害，目前該病害在我國山東、江蘇、陜西、浙江等地均有發(fā)生[6]。目前，我國所報道的櫻桃褐腐病均由鏈核盤菌屬(Monilinia spp.)侵染所引起，分別為核果鏈核盤菌(Monilinia laxa)、美澳型核果鏈核盤菌(Monilinia fructicola)和果生鏈核盤菌(Monilinia fructigena)3個種[7]，三者侵染部位存在差異，但均能侵染果實，致使果樹產量及品質受到影響[8]。大量研究發(fā)現(xiàn)，該病菌還可危害桃、杏、李、梅等核果類果樹[9]。

“瑪瑙紅”是貴州省內最為暢銷的櫻桃品種，其是貴州本地選育而成的地方優(yōu)良早熟品種，以其熟透的果子紅中透紫，像晶瑩剔透的紅瑪瑙而得名[10]?！艾旇Ъt”櫻桃果形心臟形，紫紅艷麗，風味佳，品質上乘，可溶性糖含量達到11.88%，每100g果肉中的維生素C含量更是高達22.578mg，憑借高含量的糖、酸、維生素C，享譽“中國南方櫻桃之王”之稱[11]。近年來，“瑪瑙紅”在畢節(jié)織金縣、大方縣、赫章縣以萬畝的速度推進種植，其中，織金縣規(guī)?；N植面積達2666hm2以上，櫻桃總產量更是逐年提升，為當?shù)剞r業(yè)經濟注入了新的活力。然而，褐腐病所引起的果實腐敗已成為當?shù)卣凸r亟需解決的重要問題。目前，相關科研者已對貴州櫻桃病蟲害發(fā)生的種類及危害現(xiàn)狀進行了一定的調查研究，但貴州櫻桃褐腐病的病菌分離鑒定未見報道，不能確定貴州櫻桃褐腐病的病原菌種類。因此，本研究對貴州櫻桃主產區(qū)織金縣的褐腐病進行病菌分離、鑒定，明確了當?shù)睾指〔【N類，為櫻桃褐腐病的有效防控提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 感病樣品

“瑪瑙紅”櫻桃褐腐病病樣于2020年5月采集于貴州省織金縣櫻桃種植園。

1.1.2 試驗試劑及儀器

CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、2×Bench TopTMTaq Master Mix(倍沃醫(yī)學科技有限公司)、DNA marker D2000(天根生化科技有限公司)；離心機(賽默飛世爾科技公司)、PCR儀(美國伯樂公司)、DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.1.3 培養(yǎng)基

水瓊脂培養(yǎng)基(WA)：將15g瓊脂粉加入到1000mL蒸餾水中，自然pH，121℃下滅菌20min，倒入滅過菌的培養(yǎng)皿中，備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：將200g去皮的馬鈴薯切片，用蒸餾水煮沸，經紗布過濾后，定容至1000mL，加入18g瓊脂粉以及18g葡萄糖，自然pH，121℃下滅菌20min，倒入滅過菌的培養(yǎng)皿中，備用。

1.1.4 引物

選用真菌內轉錄間隔區(qū)(internal transcribed sequence,ITS)通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增，該對引物由上海捷瑞生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離

在顯微鏡下觀察病樣，挑取褐腐病菌的分生孢子，加入到無菌水中，制成孢子懸浮液，然后將孢子懸浮液吸取至水瓊脂平板上進行涂布。培養(yǎng)24h后，在顯微鏡下將已經萌發(fā)的孢子轉接到PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5～7d，最后進行純化，并分別保存在4℃及-80℃冰箱中。

1.2.2 病原菌的鑒定

對分離純化的病原菌進行形態(tài)學觀察，記錄其形態(tài)特征。通過CTAB法提取菌株DNA[12]，使用真菌通用引物ITS1和ITS4對菌株DNA的核糖體ITS序列進行擴增。25μL PCR反應體系：12.5μL 2×Bench TopTMTaq Master Mix、上下游引物各1μL、9.5μL ddH2O、1μL菌株DNA。PCR擴增程序：94℃變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。參照崔曉霞等[13]分析方法，通過BioEide對分離菌株及參考菌株的ITS基因的序列分別進行編輯，然后用MEGA 6.0軟件采用鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建和聚類分析，依據(jù)菌株形態(tài)特征以及分子系統(tǒng)學結果對菌株進行準確鑒定。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離純化

從圖1a可知，櫻桃褐腐病能夠在葉部引起水漬狀病斑，病斑中央為灰白色，邊緣為褐色，邊界明顯。對櫻桃樣品進行病原菌分離，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)該病菌的分生孢子呈無色、單胞，形狀為檸檬形或卵形，見圖1b。通過單孢分離，共分離得到3個病原菌株，分別命名為ytys、ytys1、ytys4。

2.2 ITS序列測定與構建進化樹

通過真菌ITS通用引物ITS1/ITS4對分離菌株進行PCR擴增，并對PCR產物進行測序。通過同源性比較和構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分離得到的菌株ytys、ytys1、ytys4與M.fructicola(登錄號為KX982695、MH854789、MH854846、MH855692、MH860465、MH864497)聚于同一支，同源性達到了97%，見圖2。結合其形態(tài)學特征，確定引起織金縣“瑪瑙紅”櫻桃褐腐病的菌株ytys、ytys1、ytys4為美澳型核果褐腐病菌M.fructicola。

3 討論

近年來，隨著分子系統(tǒng)學的快速發(fā)展，形態(tài)學觀察結合分子系統(tǒng)學分析的鑒定方法在真菌鑒定中得到越來越多的應用[14]。本研究從具有典型褐腐病癥狀的病樣分離得到病原菌，通過形態(tài)學觀察和分子生物學技術鑒定，發(fā)現(xiàn)分離得到的菌株與M.fructicola高度同源，表明造成織金縣“瑪瑙紅”櫻桃褐腐病的主要病原菌為M.fructicola。目前，M.fructicola已在北京、浙江、云南、遼寧、甘肅等多地發(fā)現(xiàn)，其能侵染桃[15]、李[16]、櫻桃[17]等薔薇科果樹，對各地水果生產造成了嚴重的威脅。本次是首次在貴州櫻桃中鑒定出該病菌，鑒于其寄主廣泛、危害嚴重等特點，應及時采取綠色高效的防治措施，科學使用低毒、低殘留農藥，加強對櫻桃園的田間管理，并結合生物防治,有效地預防和控制褐腐病的發(fā)生。此外，還應加強防范其對當?shù)厮N薇科果樹的侵染，避免造成更大的經濟損失。

隨著電商平臺的不斷發(fā)展，織金縣“瑪瑙紅”櫻桃不斷開拓市場，網絡年銷售高達8t。此外，織金縣將瑪瑙紅櫻桃產業(yè)和旅游產業(yè)相結合，形成了賞花和采摘2個旅游旺季，促進了當?shù)亟洕l(fā)展，帶領農民脫貧致富。為了有效保障當?shù)貦烟耶a業(yè)的良好發(fā)展，對當?shù)胤N植區(qū)櫻桃病蟲害發(fā)生的種類進行準確鑒定是十分必要的。本研究通過對貴州櫻桃主產區(qū)織金縣的褐腐病進行病菌分離、鑒定，明確了褐腐病病菌種類，為當?shù)貦烟液指〉脑\斷及綜合防控提供理論依據(jù)，從而更好地促進當?shù)剞r業(yè)經濟增長。