北京師范大學(xué)-香港浸會(huì)大學(xué)聯(lián)合國(guó)際學(xué)院 李子威，余振輝，姚世榮

一、引言

河豚是分布在世界各地的動(dòng)物,其含有河豚毒素和TTX。河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）因?yàn)樵诤与嗌眢w中發(fā)現(xiàn)，而被命名為河豚毒素。盡管河豚毒素發(fā)現(xiàn)于河豚體內(nèi)，但是通過(guò)對(duì)其他物種以及養(yǎng)殖河豚的研究[1]，河豚并不是河豚毒素的來(lái)源。在此次研究中，取珠海市不同生長(zhǎng)年限的弓斑東方鲀作為樣本，測(cè)量器官中毒素含量以及對(duì)腸道菌群進(jìn)行16S rRNA掃描，對(duì)比其腸道菌群的差異。

二、數(shù)據(jù)和研究方法

（一）數(shù)據(jù)組成及其來(lái)源

本研究使用弓斑東方鲀（Takifugu ocellatus）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，為珠海市唐家市場(chǎng)、朝陽(yáng)市場(chǎng)獲得的野生弓斑東方鲀采用LS-MS/MS法，檢測(cè)肝、皮膚、肌肉中TTX的含量。腸道樣本取樣后送往基因公司檢測(cè)，并獲得報(bào)告，然后進(jìn)行一系列分析和檢驗(yàn)。

（二）數(shù)據(jù)取得方法

取樣記錄所有河豚魚(yú)的體重和長(zhǎng)度，解剖后，所有樣品保存在-80℃環(huán)境中。分別取10克肌肉、皮膚和肝臟，用25ml 0.1%乙酸在100℃加熱10min提取后，以7000 rpm離心5分鐘。過(guò)濾加入與混合物比例為1:1的正己烷去除脂肪。用0.1%乙酸將樣品稀釋為50ml，用0.2μmPTFE膜過(guò)濾后進(jìn)行LC/LC-MS分析。腸道取樣是基因公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序。雙端(2×300)基因測(cè)序由Illumina基因公司進(jìn)行。原始數(shù)據(jù)通過(guò)QIIME 2軟件對(duì)分解后的序列進(jìn)行定量分析。

本研究中使用總重量和總長(zhǎng)度之間的關(guān)系，TW是總重量(g)，TL是總長(zhǎng)度（cm）。

三、結(jié)果與分析

（一）河豚體長(zhǎng)以及生長(zhǎng)曲線

根據(jù)長(zhǎng)度頻數(shù)分布，弓斑東方鲀可能有3個(gè)不同的世代或年齡組。第1組長(zhǎng)度在5厘米到10厘米之間，第2組長(zhǎng)度在10厘米到14.5厘米之間，第3組長(zhǎng)度在14.5厘米到22.5厘米之間。每組選取10個(gè)樣品進(jìn)行TTX濃度檢測(cè)（如圖1）。

圖1 河豚總長(zhǎng)度與總質(zhì)量的關(guān)系圖

比較不同河豚同一組織中TTX的濃度，發(fā)現(xiàn)第2年組肝臟和皮膚的毒性最大。肝臟和皮膚中TTX的濃度從第1年到第2年逐漸升高，第3年又開(kāi)始下降。肌肉中TTX的濃度隨著年份的增加而不斷降低。

（二）腸道菌群分析

多樣性指數(shù)結(jié)果顯示，第2年河豚的腸道微生物多樣性最大，第1年河豚的腸道微生物多樣性最?。ㄈ鐖D2）。

圖2 基于Shannon多樣性指數(shù)的稀疏性曲線

由圖3數(shù)據(jù)表明，第3年河豚腸道微生物組成與第1年腸道微生物組成相似，第2年河豚的腸道微生物組成與其他年份的差異明顯。

圖3 坐標(biāo)1-2與坐標(biāo)1-3平面展示圖

表1 第1年與第3年間腸道微生物的百分位數(shù)豐度差異

表2 第1年與第2年間腸道微生物的百分位數(shù)豐度差異

表3 第2年與第3年間腸道微生物的百分位數(shù)豐度差異

有兩種優(yōu)勢(shì)腸道微生物能夠產(chǎn)生TTX，第一種為弧菌，弧菌在各組優(yōu)勢(shì)微生物中排名基本持平。第二種為擬諾卡氏菌屬，在各組優(yōu)勢(shì)微生物的排名迅速上升后又下降。

哈維弧菌群是一種能夠產(chǎn)生TTX的鰻弧菌集團(tuán),其中檢測(cè)出的相似DNA片段包括兩種細(xì)菌：副溶血性弧菌和溶藻弧菌，異型菌菌種以及藍(lán)色弧菌是否可以產(chǎn)生TTX尚未可知。ANCOM檢驗(yàn)表明，弧菌數(shù)量的變化為：1年最多，第2年下降，第3年增長(zhǎng)。

四、討論

在同一年齡的河豚體內(nèi)不同組織中TTX的濃度，肝臟毒素含量一定高于皮膚和肌肉，表明肝臟是TTX積累的主要組織。當(dāng)比較不同河豚年齡時(shí)，發(fā)現(xiàn)TTX在肝臟和皮膚中的含量從第1年到第2年呈上升趨勢(shì)，第3年又呈下降趨勢(shì)。我們推論，河豚腸道微生物多樣性越高，其體內(nèi)肝臟和皮膚中的毒素含量越高。因?yàn)橥ㄟ^(guò)分析，發(fā)現(xiàn)第2年河豚腸道微生物多樣性為最高，第1年的多樣性也高于第3年。另外在分析中發(fā)現(xiàn)，第1年河豚的腸道微生物的組成與第3年腸道微生物組成十分相似，第2年的河豚腸道微生物組成有別于第1和第3年。我們發(fā)現(xiàn)河豚肌肉中TTX的濃度會(huì)隨著年齡的增加而不斷降低，這與其體內(nèi)腸道微生物多樣性和組成沒(méi)有直接關(guān)系，因?yàn)榧∪獠皇莾?chǔ)存TTX的組織，而其TTX含量會(huì)一直降低到不能被檢測(cè)到。

弓斑東方鲀是在珠江河口一帶常見(jiàn)的河豚，剛出生的河豚一般在河口生活和覓食一到兩年，然后會(huì)游到大海生長(zhǎng)，直到身體成熟再洄游到珠江河口產(chǎn)卵繁殖下一代，因此，不同年齡的河豚腸道微生物會(huì)因環(huán)境和食物的改變而不同。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有兩種腸道優(yōu)勢(shì)微生物可以產(chǎn)生TTX，分別是弧菌和擬諾卡氏菌屬,其中有報(bào)道，達(dá)松維爾擬諾卡氏菌是一種從河豚卵巢分離出的新型的能夠產(chǎn)生TTX的放射菌類(lèi)[2]。而弧菌屬代表菌在許多攜帶TTX的動(dòng)物中占所有產(chǎn)生TTX菌株的30%以上，大多數(shù)研究表明毒素的產(chǎn)生與水生動(dòng)物微生物群的溶藻弧菌有關(guān)系[3]。根據(jù)ANCOM檢驗(yàn)可知，腸道微生物弧菌數(shù)量從先減少后增加，而擬諾卡氏菌屬，在各組優(yōu)勢(shì)微生物的排名中迅速上升后又下降。這兩種微生物，在每個(gè)階段數(shù)量的增加和減少相互補(bǔ)充，可以維持了TTX的產(chǎn)生。這兩種微生物之間可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，幫助河豚合成TTX。

第1年河豚腸道微生物中弧菌的數(shù)量最多，河豚與產(chǎn)生TTX的細(xì)菌之間可能有一些關(guān)系，因?yàn)門(mén)TX的產(chǎn)生有助于幫助野生河豚對(duì)抗天敵，且分布于生物體表或者體內(nèi)的河豚毒素具有重要的保護(hù)作用,可以警示或威懾其捕食者[4]。這些河豚毒素還可以傳遞給幼魚(yú)，有研究表明擁有河豚毒素的幼體可以防止礁石魚(yú)類(lèi)的捕捉從而提高成活率[5]，因此幼年河豚體內(nèi)弧菌數(shù)量最多有助于幼魚(yú)的存活率。