余思茗 張玥 王婷婷

乳腺癌(Breast Cancer)居全世界女性癌癥發(fā)病率首位,是危害女性生命和健康的最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一［1］。大多數(shù)乳腺癌是一種激素依賴性的高度異質(zhì)性實(shí)體瘤,預(yù)后較差,利用免疫組化進(jìn)行分子分型,根據(jù)不同分型給予個(gè)性化治療方案對(duì)于治療乳腺癌尤為重要［2］。因此深入探究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)理,給患者有效的治療手段,仍是醫(yī)學(xué)研究的重要課題之一。蛋白質(zhì)翻譯后的修飾(post-translational modifications),如磷酸化修飾、泛素化修飾、SUMO 化修飾等,可調(diào)控相關(guān)致癌因子的降解和活性,因此對(duì)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要［3］。RNF4 作為一種靶向SUMO 鏈的泛素連接酶,可通過(guò)與多種致癌因子的磷酸化形式結(jié)合,增強(qiáng)c-Myc、c-Jun 等致癌因子的穩(wěn)定性和活性,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［4,5］。同時(shí),RNF4 的活性也與多種癌癥高度相關(guān)。在30%的結(jié)腸腺癌患者樣本中,RNF4 蛋白水平顯著升高,并且高水平的RNF4 mRNA 與乳腺癌患者的低生存率也密切相關(guān)［5］。故本研究旨在探討沉默內(nèi)源性RNF4 對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及相關(guān)的分子機(jī)制,并且利用在體裸小鼠乳腺癌模型印證RNF4 作為治療乳腺癌的潛在藥物靶點(diǎn)的可能性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動(dòng)物 人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞株購(gòu)自北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源：成年Nu/Nu 裸鼠,體重18～20 g,雌性,通過(guò)本院實(shí)驗(yàn)中心外購(gòu),并寄養(yǎng)。

1.2 構(gòu)建RNF4 沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 ①選擇靶序列：RNF4 shRNA 干擾序 列：5'-GatccGGAAACTGTTGGA GATGAATTCAAGAGATTCATCTCCAACAGTTTCCTT TTTTg-3',3'-AattcAAAAAAGGAAACTGTTGGAGATG AATCTCTTGAATTCATCTCCAACAGTTTCCg-5'；②包裝慢病毒：插入RNF4 shRNA 干擾序列的慢病毒載體LV-3(pGLVH1/GFP+Puro)由上海吉瑪基因公司制備。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 種于6 孔板中,5×105個(gè)/孔,每孔加2 ml 含10%牛血清DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞融合度約達(dá)到80%時(shí),按照 Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,將 shRNA RNF4 陰性對(duì)照質(zhì)粒和 shRNA RNF4 包裝質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到 MCF-7 細(xì)胞中,6 h 后換用完全培養(yǎng)基,繼續(xù)48 h 后,檢測(cè) RNF4 表達(dá)情況,鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果；③感染慢病毒：6 孔板中,5×105個(gè)/孔,生長(zhǎng)至約60%～80%時(shí)棄DMEM,每孔加入不同慢病毒［包括空白和目的表達(dá)載體,感染復(fù)數(shù)(MOI)=30］再加入含凝聚胺(6～8 μg/ml)的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸棄含有慢病毒培養(yǎng)液,加入DMEM 繼續(xù)培養(yǎng),并在感染后每隔一定時(shí)間觀察細(xì)胞狀態(tài)。④篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株：慢病毒感染48 h 后,將 DMEM 更換為2 μg/ml 嘌呤霉素培養(yǎng)液；2 d 更換一次培養(yǎng)液,待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后傳代；超過(guò)兩代后無(wú)需再加嘌呤霉素培養(yǎng)；經(jīng)RNF4 表達(dá)驗(yàn)證后,得到RNF4 沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.3 裸鼠皮下移植瘤模型 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的、慢病毒轉(zhuǎn)染建立的穩(wěn)定沉默RNF4 的MCF-7 細(xì)胞系與陰性空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系用胰酶消化收集,并用氯化鈉注射液洗滌重懸,懸液濃度5×107個(gè)細(xì)胞/ml,將0.2 ml 的腫瘤細(xì)胞懸液于異氟烷吸入麻醉下注射于裸鼠右腋皮下。裸鼠蘇醒后送入鼠房,自由飲食。每3 天測(cè)量一次皮下移植瘤體積,連續(xù)觀察26 d 后,脫臼法處死裸鼠,提取腫瘤組織,拍照、稱重并提取腫瘤組織總蛋白,備用。

1.4 Western blot 檢測(cè)RNF4 和p53 表達(dá)水平 取小鼠瘤組織或離體培養(yǎng)的細(xì)胞,提取樣品總蛋白,依據(jù)BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒中的說(shuō)明書(shū),測(cè)定蛋白濃度。將處理好的蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)實(shí)驗(yàn),之后將蛋白條帶印跡到PVDF 膜上,脫脂牛奶室溫封閉2 h 后,孵育一抗：RNF4、GAPDH 和p53,4℃過(guò)夜。次日PBST 緩沖液 洗滌后,加入羊抗兔或鼠二抗室溫避光孵育 1 h。

1.5 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)期MCF-7 細(xì)胞種于96 孔板,3000 個(gè)/孔,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后加入10 μl 的CCK-8 反應(yīng)液,避光在培養(yǎng)箱中孵育1 h。用酶標(biāo)儀在 460 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。

1.6 主要試劑和儀器 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；shRNA RNF4 干擾質(zhì)粒及其陰性對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自廣州銳博生物科技公司；Lipofectamine 2000 試劑購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher 公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNF4 一抗、GAPDH 一抗、p53 一抗購(gòu)于美國(guó)Proteintech 公司；二抗羊抗鼠、二抗羊抗兔購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher 公司。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行圖表制作與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,腫瘤體積=1/2ab2(a=腫瘤長(zhǎng)徑,b=腫瘤短徑)。多組比較應(yīng)用單因素方差分析法(One-way ANOVA)并用Turkey 法驗(yàn)證；兩組比較應(yīng)用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LV3(H1/GFP&Puro)慢病毒穩(wěn)定沉默RNF4 的乳腺癌細(xì)胞系 通過(guò)0.5、1.0、1.5、2.0 和 2.5 μg/ml 的嘌呤霉素培養(yǎng)基進(jìn)行篩選出穩(wěn)定沉默的細(xì)胞系,與對(duì)照組(shCtl)相比,RNF4 沉默組(shRNF4)中RNF4 表達(dá)明顯降低,說(shuō)明穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系建立成功。見(jiàn)圖1。

圖1

2.2 沉默內(nèi)源性RNF4 對(duì)于腫瘤細(xì)胞活性影響 CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與shCtl 組相比,shRNF4 組癌細(xì)胞的增殖活性被顯著抑制,表明沉默內(nèi)源性RNF4 可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖2。

圖2

2.3 沉默內(nèi)源性RNF4 對(duì)于乳腺癌細(xì)胞中促凋亡蛋白p53 的影響 與shCtl 組相比,shRNF4 組中p53 表達(dá)顯著升高,表明沉默RNF4 是通過(guò)激活p53 凋亡通路起到抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。見(jiàn)圖3。

圖3

2.4 沉默內(nèi)源性RNF4 對(duì)于荷乳腺癌裸小鼠模型生長(zhǎng)的影響 連續(xù)觀測(cè)裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)26 d,各組均未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。與shCtl 組相比,shRNF4 組腫瘤生長(zhǎng)緩慢,沉默內(nèi)源性RNF4對(duì)腫瘤體積和重量有明顯的抑制作用,腫瘤體積抑制率為55.3%,瘤重抑制率為60.9%。見(jiàn)圖4。

圖4

2.5 沉默內(nèi)源性RNF4 對(duì)于乳腺癌組織中促凋亡蛋白p53 的影響 與shCtl 組比較,沉默RNF4 后,瘤組織中的p53 表達(dá)增加,與離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,說(shuō)明沉默RNF4 是通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白p53 的表達(dá),激活相關(guān)凋亡通路,從而抑制體乳腺癌的生長(zhǎng)。見(jiàn)圖5。

圖5

3 討論

乳腺癌作為危害女性健康的“第一殺手”,在臨床中的治療尚缺乏有效的措施且患者預(yù)后差［6］。已有研究表明高水平的RNF4 mRNA 與乳腺癌患者的預(yù)后差、低生存率密切相關(guān)［5］。因而,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)沉默乳腺癌細(xì)胞內(nèi)源性RNF4 發(fā)現(xiàn),促凋亡蛋白p53 表達(dá)升高,在體模型中腫瘤生長(zhǎng)緩慢,腫瘤體積和重量均顯著減少,腫瘤細(xì)胞活性被顯著抑制,提示RNF4 可能作為治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。

p53 是關(guān)鍵的抑癌基因,其編碼的蛋白質(zhì)調(diào)控著細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、新陳代謝、凋亡、氧化應(yīng)激、DNA損傷修復(fù)等過(guò)程,同時(shí)也作為轉(zhuǎn)錄激活因子促進(jìn)下游基因表達(dá),從而達(dá)到抑制腫瘤進(jìn)程的作用［7］。p53 基因突變常見(jiàn)于腫瘤患者中,可導(dǎo)致DNA 損傷修復(fù)途徑的失靈、細(xì)胞周期阻滯等,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性,加速腫瘤進(jìn)程［8］。

RNF4 作為靶向SUMO 鏈的泛素連接酶,可調(diào)控底物蛋白發(fā)生降解,參與核酸的代謝、胚胎發(fā)育、轉(zhuǎn)錄、DNA 修復(fù)及穩(wěn)定性等重要細(xì)胞活動(dòng)［9］。研究表明,RNF4 是促癌因子c-Myc 的重要靶點(diǎn)。當(dāng)Wnt 或Notch通路激活時(shí),RNF4 的表達(dá)也隨之升高［10］。與此同時(shí),RNF4 不僅沒(méi)有促進(jìn)相關(guān)致癌蛋白發(fā)生降解,反而穩(wěn)定了多種存活周期較短的致癌蛋白,如β-Catenin、c-Myc、c-Jun 等的表達(dá),并且增強(qiáng)它們的轉(zhuǎn)錄活性［5］。因此,抑制RNF4 的活性和表達(dá)可能會(huì)成為癌癥治療的有利手段。故本研究通過(guò)探討RNF4 沉默是否通過(guò)抑制p53 通路發(fā)揮促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用,為臨床靶向治療乳腺癌提供更多理論基礎(chǔ)。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)沉默RNF4,從而激活p53通路,誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡并且抑制在體乳腺癌的生長(zhǎng),揭示RNF4 可作為潛在的治療靶點(diǎn)。