朱健慧 鄭欣 彭顯 徐欣 Robert Margolskee 周學(xué)東

1.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口腔疾病臨床研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，成都610041；2.Monell Chemical Senses Center，美國費(fèi)城PA 19104

哺乳動物可感知甜、酸、咸、苦、鮮五種基本味覺，味覺感知對于個體攝取營養(yǎng)物質(zhì)、鑒別有毒有害物質(zhì)有重要意義[1]。味覺異常是以味覺改變?yōu)樘卣鞯募膊?，處于味覺異常狀態(tài)的患者容易出現(xiàn)食欲減退、營養(yǎng)不良、情緒消極等，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[2]。近日研究[3]報道新冠肺炎患者出現(xiàn)味覺感知障礙或味覺喪失，提示微生物對味覺感知的重要影響。味覺異常的病因尚不明確，但口腔衛(wèi)生狀況不佳、牙周病等口腔局部微生物因素與味覺感知的變化具有相關(guān)性[4]。

味覺感受器中的味覺受體細(xì)胞被某些物質(zhì)激活后，通過感覺神經(jīng)將味覺信號傳遞至大腦相應(yīng)區(qū)域，形成味覺感知。甜味受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）C家族，為Ⅰ型味覺受體家族（taste receptor type 1，T1R）中的兩種亞型T1R2和T1R3組成的異源二聚體，可被糖（葡萄糖、果糖等），人工甜味劑（糖精、安賽蜜等）及甜味蛋白（莫奈林、神秘果素等）等甜味配體激活產(chǎn)生甜味信號[5]。研究[6]表明，小鼠攝取脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）后，對蔗糖的甜味敏感度顯著降低，但其機(jī)制尚不明確。

可變剪接指來源于同一基因的前體mRNA經(jīng)過不同方式的剪接，形成不同的成熟mRNA，進(jìn)而翻譯為結(jié)構(gòu)、功能不盡相同的蛋白質(zhì)?？勺兗艚邮钦婧松镏袕V泛存在的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式，具有重要的生物學(xué)意義[7]。LPS可通過調(diào)控Toll樣受體下游分子MyD88編碼基因的可變剪接影響其在炎癥反應(yīng)中的功能[8]。T1R2前體mRNA包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，可能受到可變剪接調(diào)控，影響甜味感知功能。本研究旨在探究LPS對甜味受體可變剪接的影響，從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控角度揭示口腔微生物感染引起味覺感知異常的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

RNA提取試劑盒MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser、高保真DNA聚合酶Prime-STAR?Max DNA Polymerase、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ、感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5αCompetent Cells（TaKaRa公司，日本），限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ-HF/NotⅠ-HF、T4連接酶（New England Biolabs公司，美國），無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒（北京Tiangen公司），lipofectamine 2000、標(biāo)簽抗體6x-His Tag Monoclonal Antibody（Thermo Scientific公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基、添加鈣鎂的DPBS溶液（Gibco公司，美國），penicillin/streptomycin（P/S，Hyclone公司，美國），標(biāo)簽抗體Monoclonal ANTI-FLAG?M2 antibody（Sigma公司，美國），抗鼠熒光二抗Goat Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor?488/594，Abcam公司，英國），牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）（BioFroxx公司，德國）。引物合成及DNA測序由北京擎科生物科技公司完成。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）

取8周齡C57BL/6J小鼠6只（雄性3只，雌性3只），使用頸椎脫臼法處死小鼠，體視顯微鏡下分離舌背包含味蕾組織的輪廓乳頭、菌狀乳頭及葉狀乳頭，分別提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，RT-PCR擴(kuò)增完整T1R2轉(zhuǎn)錄本（正向序列：5’-AAGGCTGTTACTTGGCTGGC-3’，反向序列：5’-GGTGGGTGGGACTAGCTCTT-3’），行瓊脂糖凝膠電泳，對長度小于T1R2本構(gòu)體的DNA片段行TA克隆，隨機(jī)挑取單菌落測序。為進(jìn)一步驗(yàn)證異構(gòu)體表達(dá)，在異構(gòu)體缺失序列上、下游設(shè)計引物（正向序列5’-CAGTGGAACTGGATCGTGGT-3’，反向序列5’-GCGTCACAGTCCTGGTTACA-3’），以前述cDNA為模板，PCR擴(kuò)增異構(gòu)體對應(yīng)DNA片段，并通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 甜味受體異源性表達(dá)實(shí)驗(yàn)

1.3.1 質(zhì)粒載體構(gòu)建 RT-PCR擴(kuò)增T1R2/T1R3本構(gòu)體轉(zhuǎn)錄本、T1R2剪接異構(gòu)體（T1R2_Δe3p）轉(zhuǎn)錄本，克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+），測序驗(yàn)證序列無誤。甜味受體信號通路下游G蛋白表達(dá)質(zhì)粒Gα16-gust44-pcDNA3.1-hygro由Monell Chemical Sensens Center（費(fèi)城，美國）提供。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞在添加10%FBS和1%P/S的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種至黑色透明底96孔板，按照lipofectamine 2000說明書操作，將等量T1R2本構(gòu)體表達(dá)質(zhì)粒和（或）異構(gòu)體（T1R2_Δe3p）表達(dá)質(zhì)粒、T1R3本構(gòu)體表達(dá)質(zhì)粒及Gα16-gust44表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞。

1.3.3 FlexStation 3檢測 甜味受體功能轉(zhuǎn)染48 h后，吸出培養(yǎng)基，加載終濃度為2.5μmol·L-1的鈣離子熒光染料Fluo-4，避光孵育1 h后，再次DPBS漂洗，每孔加入50μL DPBS后避光孵育30 min。以DPBS為溶劑配制甜味配體溶液，其終濃度為蔗 糖100 mmol·L-1、葡 萄 糖100 mmol·L-1、果 糖100 mmol·L-1、糖精1 mmol·L-1、安賽蜜10 mmol·L-1、三氯蔗糖10 mmol·L-1[9]，F(xiàn)lexStation 3自動移液酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司，美國）動態(tài)監(jiān)測熒光值變化。繪制熒光強(qiáng)度（F）-時間曲線，如果配體可激活甜味受體，該曲線會在30～60 s之間出現(xiàn)峰值，計作Fpeak；每孔選取最后20 s內(nèi)10個讀數(shù)的平均值作為基線，計作F0；繪制標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度（F/F0）-時間曲線，其縱坐標(biāo)可間接反映胞內(nèi)鈣離子濃度變化。計算（Fpeak-F0）/F0代表受體-配體效應(yīng)強(qiáng)度，繪制柱狀圖比較甜味受體功能。

1.4 細(xì)胞免疫熒光檢測

在異構(gòu)體T1R2_Δe3p 3’端添加6His標(biāo)簽，在T1R2本構(gòu)體3’端添加FLAG標(biāo)簽，克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）。使用lipofectamine 2000將等量T1R2-FLAG、T1R2_Δe3p-6His、T1R3及Gα 16-gust44表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗，0.2%Triton X-100通透10 min，3%BSA封閉30 min，6His或FLAG一抗（1%BSA 1∶1 000稀釋）孵育2 h，漂洗，用帶有熒光基團(tuán)的二抗孵育1 h，再次漂洗，在10μg·mL-1DAPI溶液中孵育5 min，漂洗后使用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.5 LPS局部注射及qPCR檢測

將8周齡、雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為LPS處理組（n=5）及PBS對照組（n=5），行注射麻醉，使用LPS（5 mg·kg-1）或等體積PBS行舌背局部注射，6 h后使用頸椎脫臼法處死小鼠。分離小鼠舌背輪廓乳頭與菌狀乳頭，分別提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用T1R2_Δe3p（正向序列5’-GATCGTGGTGCTGGAGGTTC-3’，反向序列5’-GCTCAGCTCTGGCGAGAATA-3’）、T1R2（正向序列5’-CCAAGTGCAATGAGTACAACATGA-3’，反向序列5’-AGCAGACATCCACCATCTCG-3’）、T1R3（正向序列5’-GCAACCAGGTGCCAGTCT-3’，反向序列5’-AGCAGGCTGTGCTTTTCTCT-3’）特異性引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。相對表達(dá)量以βactin（正向序列5’-GGTCAGAAGGACTCCTATGTGG-3’，反向序列5’-TGTCGTCCCAGTTGGTAACA-3’）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算，并計算T1R2_Δe3p相對T1R2的表達(dá)比例。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以雙向P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甜味受體T1R2存在可變剪接異構(gòu)體T1R2_Δe3p

味蕾組織RNA行RT-PCR擴(kuò)增T1R2轉(zhuǎn)錄本，產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)T1R2存在若干較短的剪接異構(gòu)體（圖1A），測序結(jié)果顯示其中一個剪接異構(gòu)體的3號外顯子部分丟失。特異性引物qPCR反應(yīng)后通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證該異構(gòu)體表達(dá)，將其命名為T1R2_Δe3p（圖1B）。對丟失序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其5’端（GU）及3’端（AG）為內(nèi)含子特征序列，在mRNA剪接過程中可能被識別為內(nèi)含子而丟失（圖1C）。開放閱讀框分析顯示T1R2_Δe3p翻譯起始與終止位點(diǎn)未發(fā)生改變，其翻譯產(chǎn)物缺少位于胞外段配體結(jié)合區(qū)域的29個氨基酸殘基（圖1D）。

圖1 剪接異構(gòu)體T1R2_Δe3p的發(fā)現(xiàn)Fig 1 Identification of splicing isoform T1R2_Δe3p

2.2 可變剪接異構(gòu)體T1R2_Δe3p導(dǎo)致甜味受體功能下調(diào)

與T1R2/T1R3本構(gòu)體相比，T1R2_Δe3p與T1-R3組成的甜味受體受到適當(dāng)濃度的糖精、安賽蜜、三氯蔗糖、葡萄糖、果糖、蔗糖等甜味配體刺激后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化顯著下調(diào)，且與陰性對照相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。T1R2_Δe3p與T1R3組成的甜味受體無法與甜味刺激物結(jié)合產(chǎn)生味覺信號，表現(xiàn)為甜味感知功能的缺失。將T1R2_Δe3p與T1R2/T1R3共同轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞，甜味配體刺激后胞內(nèi)鈣離子濃度變化顯著下調(diào)，但高于陰性對照組（圖2）。qPCR與細(xì)胞免疫熒光圖像顯示過表達(dá)T1R2_Δe3p后，甜味受體本構(gòu)體T1R2/T1R3的mRNA和蛋白表達(dá)水平無明顯變化（圖3）。

圖2 T1R2_Δe3p對甜味受體功能的影響Fig 2 The effect of T1R2_Δe3p on thefunction of sweet tastereceptor

圖3 T1R2_Δe3p對本構(gòu)甜味受體表達(dá)量的影響Fig 3 The effect of T1R2_Δe3p on the expression of canonical sweet taste receptor

2.3 局部注射LPS后T1R2_Δe3p表達(dá)比例上調(diào)

小鼠舌背局部注射LPS后，菌狀乳頭、輪廓乳頭組織qPCR結(jié)果顯示，甜味受體T1R2/T1R3表達(dá)量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）。菌狀乳頭中T1R2_Δe3p表達(dá)量（P=0.045 4）及相對T1R2本構(gòu)體表比例（P=0.017 8）均有顯著上升（圖4），輪廓乳頭T1R2_Δe3p相對T1R2本構(gòu)體表比例顯著上升（P=0.037 1，圖4）。

圖4 LPS對T1R2/T1R3本構(gòu)體與T1R2_Δe3p表達(dá)量的影響Fig 4 Theexpression of canonical T1R2/T1R3 and T1R2_Δe3p affected by LPS

3 討論

人類的口腔作為消化道的起始，是人體與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的重要場所，有超過600種微生物定植[10]。口腔微生物不僅是齲病、牙髓病、根尖周病、牙周病等口腔常見病、多發(fā)病的最主要致病因素，還與惡性腫瘤、糖尿病、心血管疾病等全身性疾病密切相關(guān)[11]。味覺感受器位于味覺乳頭內(nèi)的味蕾中，主要分布于口腔內(nèi)的舌背黏膜，微生物作為局部刺激因素對味覺傳導(dǎo)有一定影響。

口腔衛(wèi)生狀況及感染性疾病的患病情況與味覺異常的發(fā)生有關(guān)[4]。LPS為革蘭陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，可通過活細(xì)菌外膜囊泡或死細(xì)菌崩解的方式釋放，是重要的活性致病物質(zhì)[12]。有研究[13]報道，腹腔注射LPS可升高小鼠味覺乳頭炎性因子的表達(dá)量，可能通過影響味覺前體細(xì)胞增殖參與味覺異常的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)了對甜味受體功能有顯著影響的T1R2_Δe3p，LPS局部刺激可使其表達(dá)比例升高，從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的角度解釋了微生物抗原成分引起味覺感知能力下降的原因。

甜味受體T1R2/T1R3屬于GPCR的C家族，除擁有GPCR超家族7次跨膜結(jié)構(gòu)和偶聯(lián)G蛋白引起下游分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同特點(diǎn)以外，其與配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域位于500～600個氨基酸殘基組成的氨基端末端，具有類似于捕蠅草的雙小葉空間結(jié)構(gòu)，被命名為捕蠅草結(jié)構(gòu)域（Venus flytrap domain，VFTD）[14]。本研究發(fā)現(xiàn)的T1R2剪接異構(gòu)體蛋白缺少的29個氨基酸殘基位于本構(gòu)體的VFTD內(nèi)。異源性表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示T1R2_Δe3p與T1R3共轉(zhuǎn)染后無法結(jié)合甜味配體，推斷其原因?yàn)楫悩?gòu)體蛋白無法形成可與甜味刺激物結(jié)合的VFTD結(jié)構(gòu)。過表達(dá)T1R2_Δe3p后，T1R2/T1R3本構(gòu)體在mRNA及蛋白質(zhì)水平表達(dá)量無明顯變化，但甜味受體功能明顯下調(diào)。推測其機(jī)制為T1R2_Δe3p競爭性與T1R3結(jié)合形成無功能的二聚體，抑制T1R2/T1R3二聚體的形成，整體下調(diào)甜味受體與配體的結(jié)合。

mRNA可變剪接是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵步驟，異常剪接與腫瘤、免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病等多種疾病相關(guān)[15]。可變剪接存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中剪接因子可識別前體mRNA中剪接調(diào)控元件，發(fā)揮促進(jìn)或抑制剪接的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)剪接異構(gòu)體T1R2_Δe3p對甜味受體功能有顯著抑制作用，其表達(dá)受到LPS局部刺激的調(diào)控。LPS影響甜味受體可變剪接的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，推測LPS可能通過調(diào)控某些關(guān)鍵剪接因子對T1R2_Δe3p表達(dá)產(chǎn)生影響。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)調(diào)控甜味受體可變剪接的關(guān)鍵剪接因子將為人工干預(yù)甜味受體功能提供理論基礎(chǔ)。此外，LPS局部刺激影響小鼠味覺乳頭內(nèi)T1R2_Δe3p豐度變化是否對其甜味敏感度產(chǎn)生影響仍有待進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了小鼠甜味受體T1R2的可變剪接異構(gòu)體T1R2_Δe3p，其對甜味受體T1R2/T1R3的功能有顯著抑制作用，LPS局部刺激可顯著上調(diào)T1R2_Δe3p異構(gòu)體表達(dá)，從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控角度揭示微生物感染影響宿主味覺感知的分子機(jī)制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。