楊夢琳，周小青，伍大華，張運輝，鄭彩杏，童天昊

何首烏-石菖蒲藥對治療阿爾茨海默病網絡藥理學研究及實驗驗證

楊夢琳1，2，3，周小青1，2，伍大華1，4，張運輝1，2，3，鄭彩杏1，2，童天昊1，2

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2. 2011數字中醫(yī)藥協同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208； 3.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校中醫(yī)學院，重慶 404120；4.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006

應用網絡藥理學方法預測何首烏-石菖蒲藥對治療阿爾茨海默病的作用靶點及相關信號通路，探討其作用機制。通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索并篩選何首烏、石菖蒲的潛在活性成分，并查詢活性成分作用靶點，采用DrugBank數據庫和Pharmmapper服務器預測有效化學成分的作用靶點，采用Cytoscape3.7.1軟件構建活性成分-靶點網絡；通過DrugBank、DisGeNET、HPO數據庫檢索阿爾茨海默病相關基因；將活性成分作用靶點和阿爾茨海默病相關基因進行比對，得到交集靶點，利用STRING數據庫構建蛋白相互作用網絡；使用Cytoscape3.7.1軟件根據度值、介數和緊密度篩選關鍵靶點，應用Metascape數據庫分析關鍵靶點的KEGG信號通路和GO分子功能；通過MTT、ELISA和qPCR實驗驗證何首烏-石菖蒲對PC12細胞的保護作用。共篩選出何首烏-石菖蒲藥對有效成分15個，對應靶點280個，與阿爾茨海默病交集靶點共123個，12個關鍵靶點的前10條KEGG通路和前20個GO分子功能涉及炎癥反應和凋亡等。細胞實驗表明，何首烏-石菖蒲藥對能有效提高PC12細胞存活率，抑制細胞炎癥反應，并抑制p38MAPK/NF-κB信號通路激活。何首烏-石菖蒲藥對的多種有效成分以協同方式與多個靶點、多種途徑相互作用，主要通過抑制炎癥反應、抗凋亡等對阿爾茨海默病發(fā)揮重要治療作用。

何首烏；石菖蒲；阿爾茨海默??；網絡藥理學；作用機制

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種以認知功能下降、精神行為功能障礙為主要表現的神經系統退行性病變[1]。AD已成為致老年人死亡的主要原因之一，受到全球相關研究人員的高度關注[2-3]。目前，抗AD藥物N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體阻滯劑和乙酰膽堿酯酶（ACHE）抑制劑主要針對AD的某個單一致病靶點進行預防或治療，可在一定程度上改善患者癥狀，但均不足以阻斷或逆轉其病理發(fā)展，且患者易耐藥，不良反應較多[4-5]。中醫(yī)藥治療可發(fā)揮多成分、多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點、雙向調節(jié)作用，與AD發(fā)病機制的復雜性和綜合性特征非常契合。

清代程國彭《醫(yī)學心悟》云：“腎主智，腎虛則智不足?！蹦X為髓海，腦髓的充養(yǎng)依靠腎的藏精功能，腎中精氣充盈，則髓海得養(yǎng)。清代陳士鐸《石室秘錄》認為“痰氣最盛，呆氣最深”，提出“治呆無奇法，治痰即治呆也”。因此，腎虛為本、痰濁為標是AD的重要病機，補腎化痰法是防治AD的重要治法[6]?！侗静菥V目》記載何首烏氣溫、味苦澀，制用能固精益腎、養(yǎng)血益肝、健筋骨、烏須發(fā)，為滋補腎精良藥。藥理研究表明，何首烏具有抗衰老、益智、提高免疫力、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗菌、抗癌、抗誘變等作用[7-8]。石菖蒲始載于《神農本草經》，具有豁痰開竅、醒神益智、聰耳明目、化濕開胃功用，為治忘強記益智良藥[9]，可改善學習記憶能力、影響中樞膽堿能神經功能、保護中樞神經元、抗神經細胞凋亡等[10]。數據挖掘研究表明，以補腎化痰祛瘀復方治療AD隨機對照研究的38個方劑中，使用頻次最高的補腎化痰藥對是制何首烏-石菖蒲[11]。以該藥對組方治療AD的代表方有《御藥院方》養(yǎng)壽丹[12]、還腦益聰方[13]等，兩者配伍補腎填精益智、化痰開竅，契合AD腎虛痰阻病機。本研究采用網絡藥理學方法，從分子水平分析何首烏-石菖蒲藥對的有效成分，預測其治療AD的作用靶點及相關信號通路，闡釋何首烏-石菖蒲藥對治療AD的作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分及靶點篩選

以“何首烏”“石菖蒲”為關鍵詞，檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu. edu.cn/tcmsp.php），得到2味中藥的有效成分，基于ADME（藥物吸收、分布、代謝、排泄）模型，運用OBioavail 1.1預測有效成分的口服生物利用度（OB），并以OB≥20%、類藥性（DL）≥18%為條件，對有效成分進行篩選，下載并保存為Mol2格式。借助DrugBank數據庫（https://www.drugbank.ca/）和Pharmmapper服務器（http://lilab.ecust.edu.cn/ pharmmapper/submit_file.php）查詢成分作用靶點信息。將TCMSP篩選出的何首烏和石菖蒲化學成分以Mol2格式上傳到Pharmmapper服務器，基于反向藥效團匹配法，選擇藥效團模型，設定返回靶點數目為200，得到何首烏和石菖蒲化合物潛在的靶點信息。將何首烏-石菖蒲有效成分及其對應靶點導入Cytoscape3.7.1軟件，構建有效成分-基因靶點網絡。

1.2 疾病相關靶點檢索

通過DrugBank、DisGeNET（http://www.disgenet. org/）、HPO（https://hpo.jax.org/app/）數據庫，以“Alzheimer”為關鍵詞進行檢索，將3個數據庫所得結果去除重復項，獲得AD疾病相關靶點。

1.3 藥物有效成分與疾病共同靶點篩選及蛋白相互作用網絡構建

將何首烏-石菖蒲有效成分相關靶點和AD相關靶點導入OmicShare平臺（https://www.omicshare.com/），得到二者交集靶點，將交集靶點導入STRING數據庫（https://string-db.org/），選擇物種為“Homo sapiens”（人源），相互作用閾值為“Highest confidence=0.9”，得到蛋白相互作用（PPI）網絡。

1.4 關鍵靶基因篩選

應用Cytoscape3.7.1軟件對PPI網絡進行拓撲屬性分析，計算PPI網絡整體的點度中心性（degree centrality，DC）、接近中心性（closeness centrality，CC）和中介中心性（betweenness centrality，BC），以介數（betweenness）、緊密度（closeness）和度值（degree）均大于均值的靶點為關鍵靶點。

1.5 關鍵靶點代謝通路與生物過程分析

采用Metascape平臺，選擇“Homo sapiens”（人源），對何首烏-石菖蒲治療AD關鍵靶點進行GO和KEGG通路富集分析，篩選出居前20位的分子功能和前10位的信號通路。

1.6 體外驗證實驗

1.6.1 細胞與試藥

大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞株PC12細胞，長沙贏潤生物技術有限公司；β淀粉樣蛋白（Aβ）25-35，美國Sigma公司；白細胞介素（IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA測定試劑盒，南京建成生物研究所；p38MAPK、NF-κB p65引物由上海生工生物工程有限公司合成；總RNA抽提試劑（Trizol），寶生物工程（大連）有限公司；DMEM細胞培養(yǎng)液，賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司；10%新生小牛血清，Hyclone Lab；PBS，北京索萊寶科技有限公司；FBS，吉泰遠成生物科技有限公司。制何首烏100 g、石菖蒲80 g，湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。按3∶2比例稱取制何首烏、石菖蒲，經水提、蒸發(fā)、濃縮為不流動的浸膏，使用時稱取適量，溶解，過濾膜除菌后于-20 ℃保存。

1.6.2 細胞培養(yǎng)、分組及干預

PC12細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS、1%青鏈霉素），37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞貼壁后取對數生長期細胞，分為對照組、模型組及制何首烏-石菖蒲低、中、高劑量組。對照組加入不含FBS、青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基孵育24 h；模型組予Aβ25-35（20 μmol/L）孵育24 h[14]；制何首烏-石菖蒲低、中、高劑量組分別予Aβ25-35（20 μmol/L）＋藥物浸膏10、20、40 μg/mL孵育24 h。

1.6.3 MTT比色法檢測細胞存活率

將5×MTT用稀釋液稀釋成1×MTT溶液，每孔加1×MTT溶液50 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清液，每孔加入200 μL DMSO，在平板搖床上搖2～3 min使均勻，于酶標儀570 nm波長處檢測吸光度（OD值），計算PC12細胞存活率。細胞存活率（%）＝（實驗組OD值－空白組OD值）÷（對照組OD值－空白組OD值）×100%。

1.6.4 ELISA檢測炎癥因子含量

PC12細胞以1×107個/mL濃度接種于96孔板，100 μL/孔，當融合80%時，各組分別給予相應處理因素，每組設3個復孔。處理完成后收集上清液，采用ELISA測定IL-1β、IL-6和TNF-α含量，按試劑盒說明書進行操作。

1.6.5 qPCR檢測p38MAPK、NF-κB p65 mRNA表達

Trizol法提取PC12細胞總RNA，反轉錄合成cDNA。使用Primer-BLAST設計引物序列（見表1）。反應條件為：95 ℃、3 min→95 ℃、5 s→60 ℃、1 min，40個循環(huán)；95 ℃、15 s→55 ℃、1 min→95 ℃、30 s。數據采用雙標準曲線法處理，樣本相對定量＝目的基因含量/內參基因含量，計算待測組目的基因相對于對照組的表達差異倍數。

表1 qPCR引物序列

基因名稱引物（5’～3’）產物長度/bp β-actinF：CGCGAGTACAACCTTCTTGC 70 R：CGTCATCCATGGCGAACTGG p38MAPKF：GCACTACAACCAGACAGTGGA129 R：GTCCCCGTCAGACGCATTAT NF-κB p65F：CTGCGATACCTTAATGACAGCG194 R：AATTTGGCTTCCTTTCTTGGCT

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 何首烏-石菖蒲有效成分

共篩選出何首烏-石菖蒲藥對有效成分15個，其中何首烏有效成分9個（M1～M9），石菖蒲有效成分6個（M10～M15），見表2。

2.2 藥物有效成分-靶點網絡

將何首烏-石菖蒲藥對有效成分及相關靶點導入Cytoscape3.7.1構建有效成分-靶點網絡，見圖1。圖中包括何首烏有效成分9個、石菖蒲有效成分6個、有效成分作用靶點280個，邊代表靶點與化學成分之間的相互作用，共1 704條，體現了何首烏-石菖蒲多成分、多靶點的作用特點。

表2 何首烏-石菖蒲有效成分基本信息

編號成分中文名分子量OB/%DL M1rhein大黃酸284.2347.070.28 M2tetrahydroxy stilbene glycoside二苯乙烯苷406.3936.080.56 M3guajavarin扁蓄苷434.3829.650.70 M4tricin麥黃酮330.3127.860.34 M5questinol奎硫醇300.2824.490.30 M6emodin大黃素270.2524.400.24 M7physcion大黃素甲醚284.2822.290.27 M8polydatin虎杖苷390.4221.440.50 M9questin單甲醚284.2820.440.27 M108-Isopentenyl-kaempferol去甲脫水淫羊藿黃素354.4038.040.39 M11α-asaroneα-細辛醚208.2542.051.06 M12β-asaroneβ-細辛醚208.2536.920.85 M13(7S,7’S,8R,8’R)-eudesmin桉脂素386.4036.850.87 M14cycloartenol環(huán)阿屯醇426.7038.690.78 M15kaempferol山柰酚286.2441.880.20

2.3 阿爾茨海默病相關基因

通過DrugBank、DisGeNET和HPO數據庫檢索到AD相關靶點2 156個。

2.4 蛋白相互作用網絡

通過比對得到AD相關靶點與何首烏-石菖蒲作用靶點的交集靶點123個，可能為何首烏-石菖蒲治療AD的潛在靶點，PPI網絡見圖2，包括123個靶蛋白和806條代表蛋白之間相互作用的邊。

2.5 核心靶點分析

通過Cytoscape3.7.1計算，PPI網絡平均度值為13.16，平均介數為3.60×10-2，平均緊密度為0.58，度值、介數和緊密度均超過平均值的靶蛋白共12個，依次為MAPK1、MAPK14、MAPK8、TNF、CASP3、BAX、AKT1、GSK3β、INSR、CASP7、IL2、F2。這12個靶點在PPI網絡中處于關鍵位置，可能為何首烏-石菖蒲治療AD的關鍵靶點。

注：紅色為何首烏有效成分，藍色為石菖蒲有效成分，綠色為作用靶點

圖2 何首烏-石菖蒲治療AD靶蛋白PPI網絡

2.6 GO和KEGG富集分析

GO富集分析顯示，何首烏-石菖蒲治療AD關鍵靶點的分子功能有炎癥反應、MAPK級聯反應、老化、記憶、NF-κB活性的正調控、凋亡過程、神經元凋亡過程的正調控、信號轉導、缺氧反應等條目（見圖3），表明何首烏-石菖蒲治療AD的機制可能與炎癥反應和凋亡途徑密切相關。KEGG富集分析顯示，關鍵靶點所參與的通路主要涉及阿爾茨海默病、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、AGE-RAGE信號通路、Wnt信號通路、PI3K-Akt信號通路等（見圖4），表明何首烏-石菖蒲可能主要通過調控炎癥反應和凋亡信號通路治療AD。

圖3 何首烏-石菖蒲治療AD關鍵靶點GO富集分析分子功能氣泡圖

圖4 何首烏-石菖蒲治療AD關鍵靶點KEGG富集分析代表性通路

2.7 制何首烏-石菖蒲對PC12細胞存活率的影響

與對照組比較，模型組PC12細胞存活率明顯降低，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，隨著制何首烏-石菖蒲濃度升高，PC12細胞存活率顯著上升（＜0.05，＜0.01），表明制何首烏-石菖蒲對PC12細胞具有明顯保護作用。見表3。

表3 各組PC12細胞存活率比較（±s，%）

注：與對照組比較，**＜0.01；與模型組比較，▲＜0.05，▲▲＜0.01

2.8 制何首烏-石菖蒲對PC12細胞上清液炎癥因子含量的影響

PC12細胞培養(yǎng)24 h后，與對照組比較，模型組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，制何首烏-石菖蒲中、高劑量組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著降低（＜0.05，＜0.01），表明制何首烏-石菖蒲對PC12細胞炎癥反應有明顯抑制作用。見表4。

表4 各組PC12細胞上清液IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較（±s，pg/mL，n＝3）

注：與對照組比較，**＜0.01；與模型組比較，▲＜0.05，▲▲＜0.01

2.9 制何首烏-石菖蒲對PC12細胞p38MAPK、NF-κB p65 mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組p38MAPK、NF-κB p65 mRNA表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，制何首烏-石菖蒲低、中、高劑量組p38MAPK、NF-κB p65 mRNA表達明顯降低（＜0.05，＜0.01）。見表5。

表5 各組PC12細胞p38MAPK、NF-κB p65 mRNA表達比較（±s）

注：與對照組比較，**＜0.01；與模型組比較，▲＜0.05，▲▲＜0.01

3 討論

本研究篩選出何首烏-石菖蒲的有效成分，并得出該藥對治療AD相關靶點。何首烏有效成分中二苯乙烯苷（M2）活性最高，可作用于43個靶點，石菖蒲中活性最高的成分是β-細辛醚（M12），作用靶點達36個。研究發(fā)現，二苯乙烯苷可降低BACE1、Caspase-3表達，減少Aβ產生，改善神經元損傷，從而發(fā)揮對AD的治療作用[15-16]。β-細辛醚可調節(jié)β淀粉樣前體蛋白的過量表達、分解排泄和自由基代謝，從而發(fā)揮治療AD的作用[17-18]。

在本研究篩選出的信號通路中，與何首烏-石菖蒲靶點關聯度最高的是MAPK信號通路，其次為NF-κB信號通路和IL-17信號通路。MAPK信號通路在哺乳動物類細胞主要由p38信號通路、ERK信號通路和JNK信號通路組成。據報道，癡呆的嚴重程度與p38在腦組織中表達水平高低有很大關聯[19]。Aβ和細胞因子可活化p38，刺激炎性細胞產生炎性因子及超氧自由基，這些物質可不斷激活炎性細胞，進一步加重炎癥反應，從而促進AD的發(fā)生和發(fā)展[20]。核因子-κB（NF-κB）不僅參與學習記憶、機體免疫、神經元可塑性調節(jié)，還參與神經系統中多種基因的調控、細胞凋亡信號的傳導過程，在一定程度上影響AD的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，Aβ可激活體外培養(yǎng)的神經細胞內NF-κB[21]，被激活的NF-κB轉錄入核，進一步表達促炎介質[22]，IL-1、IL-6等促炎介質通過正反饋提高NF-κB活性，使炎癥因子不斷產生和釋放，即啟動神經炎癥級聯反應，導致炎癥反應擴大，從而導致神經元損傷。NF-κB作為P38MAPK的重要下游信號因子，直接激活p38MAPK后可誘導NF-κB活化[23]。本研究顯示，制何首烏-石菖蒲能有效抑制p38MAPK/NF-κB信號通路的激活，進而抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞的炎癥反應。

細胞實驗結果表明，制何首烏-石菖蒲水提取物能有效抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞炎癥反應，提高細胞存活率，下調p38MAPK/NF-κB信號通路。

綜上，何首烏-石菖蒲治療AD具有多通路、多靶點協同作用，本研究結果可為臨床治療AD提供依據。

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Network Pharmacology Research and Experimental Calidation of Polygonimultiflori Radix- Acori Tatarinowii Rhizoma in Treating Alzheimer Disease

YANG Menglin1,2,3, ZHOU Xiaoqing1,2, WU Dahua1,4, ZHANG Yunhui1,2,3, ZHENG Caixing1,2, TONG Tianhao1,2

To predict the targets and related signaling pathways of Polygonimultiflori Radix-Acori Tatarinowii Rhizoma in the treatment of Alzheimer disease and explore the mechanism by network pharmacology method.The potential active components of Polygonimultiflori Radix and Acori Tatarinowii Rhizoma were searched and screened through TCMSP databases, and queried the target points of the active ingredients. The targets of the effective chemical constituents of Polygonimultiflori Radix-Acori Tatarinowii Rhizoma was predicted by DrugBank database and Pharmmapper server, and the active components-targets network was construct by Cytoscape 3.7.1. Alzheimer disease related genes were retrieved through DrugBank, DisGeNET, HPO databases. The intersection target was obtained by comparing the target of the active ingredient with the genes related to Alzheimer disease, and the protein interaction network was constructed by the STRING databases. Cytoscape 3.7.1 software was used to screen key targets based on degree value, betweenness and tightness, and Metascape database was used to analyze the KEGG signal pathway and GO molecular function of key targets. The protective effect of Polygonimultiflori Radix-Acori Tatarinowii Rhizoma on PC12 cells was verified by MTT, ELISA and qPCR experiments.A total of 15 active components of Polygonimultiflori Radix-Acori Tatarinowii Rhizoma were screened, corresponded to 280 targets, included 123 targets that intersect with Alzheimer disease, the top 10 KEGG signaling pathways and the top 20 GO molecular functions of 12 key target involved inflammation, apoptosis, etc. Cell experiments also proved that Polygonimultiflori Radix-Acori Tatarinowii Rhizoma could effectively improved the cell survival rate of PC12 cells, and inhibited inflammation of PC12 cells and the activation of p38MAPK/NF-κB signaling pathway.A variety of active components of Polygonimultiflori Radix-Acori Tatarinowii Rhizoma interact with multiple targets and multiple pathways in a synergistic manner, and play an important role in the treatment of Alzheimer disease mainly by inhibiting inflammation and anti-apoptosis.

Polygonimultiflori Radix; Acori Tatarinowii Rhizoma; Alzheimer disease; network pharmacology; mechanism of action

R259.92；R285

A

1005-5304(2021)08-0036-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202005395

國家自然科學基金（81373702、81874462）

周小青，E-mail：1470128077@qq.com

（收稿日期：2020-05-22）

（修回日期：2020-06-24；編輯：陳靜）