唐云，郭志華，張彤瑜，龍云，李雅

益心泰醇提物對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的兔心肌成纖維細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

唐云1，郭志華2，張彤瑜1，龍云1，李雅3

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院湖南 長沙 410208； 3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 4 10208

觀察益心泰醇提物對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的兔心肌成纖維細(xì)胞（CFs）Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，探討其抗心肌纖維化的作用機制。提取新生兔CFs，細(xì)胞分為對照組、模型組、氯沙坦鉀組和益心泰醇提物低、中、高劑量組。除對照組外，其余各組細(xì)胞予AngⅡ處理12 h建立心肌纖維化模型，再加入相應(yīng)濃度藥物培養(yǎng)一定時間，對照組加入不含AngⅡ和藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)，CCK-8法檢測CFs細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。與對照組比較，模型組CFs細(xì)胞活力明顯升高，Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，益心泰醇提物低、中、高劑量組CFs細(xì)胞活力明顯降低，Bax蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05，＜0.01），益心泰醇提物中、高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯升高（＜0.05，＜0.01）。益心泰醇提物可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化，其機制可能與抑制CFs增殖、降低細(xì)胞活力和Bcl-2蛋白表達(dá)、升高Bax蛋白表達(dá)、促進CFs凋亡有關(guān)。

益心泰醇提取物；心肌成纖維細(xì)胞；血管緊張素Ⅱ；細(xì)胞凋亡；兔

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）時膠原纖維過度沉積，導(dǎo)致正常心肌細(xì)胞活動受限，心室壁僵硬，心臟收縮力減弱，心功能下降，可使心肌組織電活動異常并加速心肌組織壞死。MF可發(fā)生于多種心血管疾病，是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，也是終末期心力衰竭的主要因素[1-2]。因此，對MF進行干預(yù)尤為重要。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）與MF密切相關(guān)，研究表明，AngⅡ可促進心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）增殖與分化，使CFs纖維化[3]。MF病理機制復(fù)雜，目前研究顯示，CFs凋亡異常是其重要機制之一[4]。Bcl-2家族蛋白主要參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，且廣泛存在于心肌細(xì)胞中，主要有抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax。當(dāng)二者比值降低時，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[5]。慢性心力衰竭屬本虛標(biāo)實之證，其病機可概括為虛、瘀、水[6]，其虛以氣虛為主。益心泰是本課題組根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)的經(jīng)驗方，動物實驗顯示，益心泰能改善慢性心力衰竭大鼠和兔心室重構(gòu)，提高心臟功能[7-9]。本研究采用AngⅡ誘導(dǎo)CFs作為研究對象，觀察益心泰醇提取物對CFs Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響，探討其抗MF的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

普通級新西蘭兔60只，雌雄各半，體質(zhì)量40～100 g，購于湖南太平生物科技有限公司，動物質(zhì)量合格證號43608300000677，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審查批準(zhǔn)（LL201810801）。

1.2 藥物及制備

益心泰由黃芪、丹參、紅花、澤瀉、豬苓按3∶1.5∶1∶1∶1比例組成，飲片購自昌都振興中藥飲片實業(yè)有限公司，所有飲片混勻后加入8倍量70%乙醇回流提取120 min，再加入6倍量70%乙醇回流提取90 min，合并提取液，過濾，減壓濃縮，于105 ℃真空干燥3 h，制備益心泰醇提物干粉，相當(dāng)于含原藥材3.67 g/g干粉。氯沙坦鉀片，杭州默沙東制藥有限公司，批號20171020，50 mg/片。

1.3 主要試劑與儀器

0.25%胰蛋白酶消化液，美國Thermo Fisher Scientific，貨號25200056；DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone，批號SH30022.01B；胎牛血清（FBS），美國Gibco，批號10270-106；波形蛋白抗體，上海聯(lián)邁，貨號LM-0756R；AngⅡ，廣州威佳，貨號A9525；CCK8試劑盒，蘇州瑞諾德，貨號CK04；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，上海碧云天，貨號C1062S；羊抗兔二抗，美國Thermo Fisher Scientific，貨號G21234；羊抗鼠二抗，美國Thermo Fisher Scientific，貨號G21040；蛋白Marker，北京全氏金，貨號DM111-01；Bax抗體，美國CST，貨號2772S；Bcl-2抗體，美國CST公司，貨號2762S；GAPDH抗體，英國Abcam公司，貨號ab181602。倒置顯微鏡（日本Olympus公司，BX51），分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific，NanoDrop 2000），流式細(xì)胞儀（美國BD，F(xiàn)ACSCalibur），熱電酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific，MK3），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能，Tanon 1600）。

1.4 心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及純度鑒定

取新生1～3 d新西蘭兔，分離心臟，取左心室心尖組織，PBS清洗，切成1 mm3小塊；加入10倍體積0.25%胰蛋白酶消化液，吹打分散細(xì)胞，置于37 ℃水浴中消化5 min，自然沉淀，棄上清液，加0.25%胰蛋白酶消化液，吹打均勻，37 ℃消化5 min，自然沉淀，取上清液，800 r/min離心10 min，棄上清液，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；未消化的組織繼續(xù)消化，重復(fù)上述步驟5次。收集細(xì)胞懸液，吹打均勻后過濾，置于培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，采用差速貼壁法，倒出培養(yǎng)液，加入新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，采用2～4代細(xì)胞進行實驗。倒置顯微鏡下觀察，免疫組化檢測波形蛋白陽性表達(dá)，計算CFs純度（90%以上）。

1.5 分組及干預(yù)

CFs分為對照組、模型組、氯沙坦鉀組（600 mg/L）和益心泰醇提物低（50 mg/L）、中（100 mg/L）、高（200 mg/L）劑量組，除對照組外，其余各組細(xì)胞予10-7mol/L AngⅡ處理12 h，再加入對應(yīng)濃度藥物培養(yǎng)一定時間，對照組加入不含AngⅡ和藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6 細(xì)胞活力檢測

將細(xì)胞以2×103個/孔接種至96孔板，按“1.5”項下方法處理，加入對應(yīng)濃度藥物培養(yǎng)4 d，每孔加10 μL CCK8溶液，于酶標(biāo)儀波長450 nm處測定各孔OD值。

1.7 細(xì)胞凋亡率檢測

將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個/mL，接種于6孔板，按“1.5”項下方法處理細(xì)胞，加入對應(yīng)濃度藥物培養(yǎng)48 h，用不含EDTA胰蛋白酶消化細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，離心，棄上清，加300 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，置于Falcon試管中，加5 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min，加5 μL碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀測定，F(xiàn)lowJo流式分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.8 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個/mL，接種于10 cm培養(yǎng)皿中，按“1.5”項下條件處理細(xì)胞，加入對應(yīng)濃度藥物培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，上樣，80 V電泳15 min，調(diào)整電壓至120 V，直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，加入Bax、Bcl-2、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育45 min，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像，Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計算Bax、Bcl-2蛋白條帶灰度值與內(nèi)參的比值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 益心泰醇提物對模型細(xì)胞形態(tài)的影響

對照組CFs形狀不規(guī)則，細(xì)胞胞體、胞核大小正常，無自主搏動；模型組CFs增殖明顯，呈融合狀態(tài)，細(xì)胞胞體、胞核體積增大；各給藥組CFs數(shù)量、細(xì)胞胞體體積、細(xì)胞周圍纖維狀絲均有不同程度減少，氯沙坦鉀組和益心泰醇提物高劑量組最明顯。見圖1。

2.2 益心泰醇提物對模型細(xì)胞活力的影響

與對照組比較，模型組CFs細(xì)胞活力顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組CFs細(xì)胞活力明顯降低（＜0.05，＜0.01）。見表1。

圖1 各組CFs形態(tài)觀察

表1 各組CFs細(xì)胞活力比較（±s）

注：與對照組比較，##＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01

2.3 益心泰醇提物對模型細(xì)胞凋亡率的影響

與對照組比較，模型組CFs凋亡率明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，益心泰醇提物中、高劑量組和氯沙坦鉀組CFs凋亡率明顯升高（＜0.05，＜0.01）。見表2、圖2。

表2 各組CFs凋亡率比較（）

注：與對照組比較，##＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01

圖2 各組CFs凋亡率流式細(xì)胞圖

2.4 益心泰醇提物對模型細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組CFs Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組CFs Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05，＜0.01）。見表3、圖3。

表3 各組CFs Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較（）

模型組 50.288±0.091##3.432±1.139## 益心泰醇提物低劑量組 5050.425±0.143*2.658±1.346* 益心泰醇提物中劑量組10050.697±0.179**2.247±0. 965** 益心泰醇提物高劑量組20050.752±0.143**1.464±0.307** 氯沙坦鉀組60050.869±0.212**0.955±0.413**

注：與對照組比較，##＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01

注：A.對照組；B.模型組；C.益心泰醇提物低劑量組；D.益心泰醇提物中劑量組；E.益心泰醇提物高劑量組；F.氯沙坦鉀組

圖3 各組CFs Bax、Bcl-2蛋白免疫印跡圖

3 討論

MF是指心肌組織中CFs過度增殖，使細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維、膠原蛋白等過度沉積。CFs約占心臟組織的2/3，是非心肌細(xì)胞的主要組成部分，也是合成細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞。CFs活化是評價MF的重要指標(biāo)，活化后的CFs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致心室重構(gòu)、心臟肌肉僵硬，影響心臟功能，最后發(fā)展為心力衰竭[10]。

本實驗結(jié)果顯示，模型組CFs增殖明顯，細(xì)胞呈融合狀態(tài)，部分細(xì)胞周圍有纖維狀絲，細(xì)胞胞體、胞核體積增大，細(xì)胞活力升高，Bax表達(dá)顯著降低， Bcl-2表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著下降，表明AngⅡ可促進CFs增殖，提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡。與模型組比較，益心泰醇提物各劑量組CFs細(xì)胞活力明顯降低，Bax蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，益心泰醇提物中、高劑量組CFs凋亡率有所升高，表明益心泰醇提物可抑制CFs增殖，降低細(xì)胞活力，升高Bax表達(dá)，降低Bcl-2表達(dá)，促進細(xì)胞凋亡。

益心泰有益氣溫陽、活血利水功效，方中黃芪為君藥，丹參為臣藥。研究表明，黃芪主要有效成分黃芪甲苷可降低心肌梗死大鼠心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)，提高射血分?jǐn)?shù)，改善心室重構(gòu)，延緩心肌纖維化[11]。心肌缺血再灌注時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激，激活凋亡信號通路，黃芪甲苷可介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕細(xì)胞損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡[12]。丹參主要有效成分丹參酮ⅡA可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3的水平，降低左室舒張末期容積、左室收縮末期容積，提高左室射血分?jǐn)?shù)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心室重構(gòu)，提高心功能[13]。

綜上，益心泰醇提物可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的MF，其機制可能與抑制CFs增殖、降低細(xì)胞活力和Bcl-2蛋白表達(dá)、升高Bax蛋白表達(dá)、促進CFs凋亡有關(guān)。

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Effects ofAlcohol Extract on Expressions of Bax and Bcl-2 Protein in Angiotensin Ⅱ-induced Cardiac Fibroblasts in Rabbits

TANG Yun1, GUO Zhihua2, ZHANG Tongyu1, LONG Yun1, LI Ya3

To observe the effects ofalcohol extract on the expressions of Bax and Bcl-2 protein in angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ)-induced cardiac fibroblasts (CFs) in rabbits; To explore the mechanism of anti-myocardial fibrosis ofalcohol extract.The CFs of newborn rabbits were extracted, and the cells were divided into control group, model group, Losartan potassium groupandalcohol extract low-, medium-, high-dosage groups. Except for the control group, cells in other groups were treated with Ang Ⅱ for 12 h to establish a myocardial fibrosis model, and then added with the corresponding concentration of drugs for a certain period of time. The control group was cultured with medium without Ang Ⅱ or drugs. CCK-8 method was used to detect cell viability, flow cytometry was used to detect cell apoptosis rate, and Western blot was used to detect expressions of Bax and Bcl-2 protein.Compared with the control group, the cell viability of CFs in the model group increased, the expression of Bax protein significantly decreased, the expression of Bcl-2 protein significantly increased, and the apoptosis rate significantly decreased (<0.01). Compared with the model group, the cell viability of CFs inalcohol extract low-, medium-, and high-dosage groups was significantly reduced, the expression of Bax protein significantly increased, and the expression of Bcl-2 protein significantly decreased (<0.05,<0.01); apoptosis rate of CFs inalcohol extract medium- and high-dosage groups significantly increased (<0.05,<0.01).alcohol extract can inhibit AngⅡ-induced myocardial fibrosis, and its mechanism may be related to inhibiting CFs proliferation, reducing cell viability and Bcl-2 protein expression, increasing Bax protein expression, and promoting CFs apoptosis.

alcohol extract; cardiac fibroblasts; angiotensin Ⅱ; cell poptosis; rabbits

R285.5

A

1005-5304(2021)08-0083-04

10.19879/j.cnki.1005-5304.202012520

國家自然科學(xué)基金（81673955）；重大疑難疾病慢性心力衰竭中西醫(yī)臨床協(xié)作試點項目（2018年）；湖南省衛(wèi)生計生科研計劃（20200592、20180710）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)一流學(xué)科開放基金（2018ZYX43）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)國內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科（2018年）；湖南省科技計劃（2018JJ2304）

李雅，E-mail：liya112@163.com

（收稿日期：2020-12-29）

（修回日期：2021-01-14；編輯：華強）